Uracil in DNA - necessary intermediate for antibody maturation and mutagenic lesion
Doctoral thesis
Permanent lenke
http://hdl.handle.net/11250/297957Utgivelsesdato
2015Metadata
Vis full innførselSamlinger
Sammendrag
Uracil in DNA - et viktig mellomprodukt for adaptiv immunitet og mutagen skade
Uracil er en av fire nukleobaser i RNA, men små mengder kan også befinne seg i
DNA. Det er to kilder til genomisk uracil: misinkorporering av deoksyuridin trifosfat (dUTP)
i steden for deoksytymidin trifosfat (dTTP) under DNA replikasjon, og deaminering av
cytosin. dUTP misinkorporering danner uracil:adenin (U:A) par uten konsekvenser for
genetisk informasjon. Cytosin deaminering resulterer derimot i uracil:guanin (U:G) par med
mutagent potensiale. U:G par har derfor lenge blitt ansett som DNA skade, men i
begynnelsen av 2000 tallet ble det etterhvert også klart at activation induced deaminase
(AID) drevet cytosin deamineringer startpunktet for antistoffsmodningsprosessene somatisk
hypermutasjon (SHM) og klasseskift rekombinajon (CSR). Til tross for sin rolle i det
antistoffmodning har sekvensringsekperimenter av kreftgenomer vist at andre cytosin
deaminaser (APOBECer) er ansvarlige for mutasjonssignaturer i mange ulike krefttyper.
Vårt arbeid har fokusert på uracils tilknytning til kreft og adaptiv immunitet. Mange
uracil-relaterte observasjoner kommer fra musemodeller. I artikkel I undersøkte vi derfor
aktivitetsnivå og mengde av tre uracilreparerende enzymer UNG2, SMUG1 og TDG i ulike
cellelinjer fra menneske og mus. Vi fant at den totale uracilfjerningskapasiteten fra U:A og
U:G substrater var større i humane celler enn for museceller, hovedsakelig fordi UNG-nivået
var høyere. I museceller stod SMUG1 for 50 % av uracil-fjerningskapasitet fra U:G substrat,
men bare 1 % i humane celler. Slike forskjeller er viktige å ta i betraktning når man bruker
musemodeller i forskning rettet mot genomisk uracil. Vi stimulerte videre primære B-celler
fra mus til å gjennomgå CSR. UNG og SMUG1 aktivitet i de stimulerte B-cellene var på
samme nivå som i de øvrige musecellelinjene, hvilket indikerer at både UNG og SMUG1 er
uttrykt og kan fjerne U:G fra deaminert cytosiner i aktiverte B-celler.
Flere forskningsgrupper har forsøkt å måle genomiske uracilnivåer, men resultatene
deres varierte med nesten tre størrelsesordener. De store forskjellene i målte uracilnivåer kan
forklares med biologiske ulikheter i prøvene til de ulike gruppene, men vi foreslår at det
stammer fra tekniske svakheter i målemetodene. I artikkel II identifiserte vi og løste
problemer ved DNA preparasjon som bidro til overvurderingen av uracilnivåer, hovedsakelig
fra med-isolert dUMP og in vitro-generert uracil fra cytosindeaminering. Vi presenter en
metode for absolutt kvantifisering av genomisk uracil hvor DNA hydrolyseres med enzymer
til nucleosider, deoksycytidin fjernes ved væskekromatografi-fraksjonering, og deoxyuridin
måles gjennom væskekromatografi-massespektrometri (LC/MS/MS). Vi testet metoden i en
relevant biologiske sammenheng ved måling av genomisk uracilnivåer i mus embryonale
fibroblaster (MEFer) og humane lymfoblastoide cellelinjer som ikke utrykker UNG. Vi fant
at de UNG-manglene cellene inneholdte fem- til elve ganger mer genomisk uracil. Videre
observerte vi at UNG-kompetente celler inneholdt 400 til 600 uraciler per genom. Våre
uracilmålinger er lavere enn tidligere rapporterte genomisk uracil verdier. Dette indikerer at
det basale uracil nivået har blitt overvurdert og at vår metode gir den mest nøyaktige uracil
kvantifiseringen.
UNG2 er ansett som den viktigste glycosylasen i reparasjon av genomisk uracil, mens
SMUG1 fungerer som støtte. I artikkel III studerte vi rollene til de to glycosylasene ved bruk
av Ung-/-Smug1-/- mus. Vi observerte at SMUG1i hovedsak står for genomisk 5-
hydroxymethyluracil (5-hmU) fjerningsaktivitet i musevev og MEFer, og at Smug1-/- mus
akkumulerte 5-hmU. I motsetning til dette hadde SMUG1-status ingen effekt på genomiske
uracil nivåer og nesten ingen effekt på uracil fjerningsaktivitet. Fjerningsaktivteten ble kun
funnet lavere i Smug1+/- og Smug1-/- hjerneprøver. UNG-mangel reduserte uracil
fjerningsaktiviteten i alle vevsprøver bortsett fra hjerne, og Ung-/- mus hadde to- til tre-gang
høyere genomiske uracilnivåer enn villtype mus. Vi fant imidlertid en mye større økning, 3-
til 20-ganger, av genomiske uracilnivåer i Ung-/-Smug1-/- mus, i tillegg til en komplett
ablasjon av uracil fjerningsaktiviteten. Vi forutsetter derfor at UNG er i hovedsak ansvarlig
for uracil-fjerningsaktivitet i alle testete vev bortsett fra hjerne med SMUG1 som støtte, og at
enten UNG eller SMUG1 er tilstrekkelig for å opprettholde basale nivåer av genomisk uracil.
Selv om det er mange bevis for at AID og APOBEC mutasjonssignaturer i kreft
stammer fra enzymatisk cytosin deaminering har uracilnivåer ikke ble testet i sammenheng
med AID og APOBEC uttrykk. I artikkel IV målte og korrelerte vi derfor genomisk uracil- og
AID-nivåer i en rekke ulike B-celle lymfomcellelinjer. Vi fant tydelig korrelasjon mellom
genomisk uracil og AID uttrykk i lymfomcellelinjer, og ingen korrelasjon i ikkelymfomcellelinjer.
I tillegg økte eller reduserte vi AID nivåer ved AID-overuttrykk, B-celle
stimulering og shRNA mediert AID ekspresjonshemming. Vi observerte at AID økning førte
til mer genomisk uracil mens AID senking reduserte mengden genomisk uracil. Vi korrelerte
genomisk uracil med uracil-DNA glykosylasenivåer, men fant kun svakere korrelasjoner enn
med AID uttrykk og kun i ikke-lymfomcellelinjer. Ved repetisjon av sekvenseringsanalysene
rettet mot APOBEC mutasjonssignaturer fant vi en AID-spesifikke mutasjonssignatur i Bcelle
lymfomer og kronisk lymfatisk leukemi. Vi har dermed påvist at høye AID uttrykk
følges av genomisk uracil akkumulering og at dette er assosiert med kreft in vivo.
I sum har dette arbeidet bidratt til bedre forståelse av de biologiske egenskapene til
genomisk uracil og de proteinene som kontrollerer dets nivåer. Dette har gitt ny innsikt i
hvordan uracil prosesseres og hva konsekvensene er ved feilregulering
Består av
Paper 1: Doseth, Berit; Visnes, Torkild; Wallenius, Anders; Ericsson, Ida; Sarno, Antonio; Pettersen, Henrik Sahlin; Flatberg, Arnar; Catterall, Tara Cherie; Slupphaug, Geir; Krokan, Hans Einar; Kavli, Bodil Merete. Uracil-DNA Glycosylase in Base Excision Repair and Adaptive Immunity: SPECIES DIFFERENCES BETWEEN MAN AND MOUSE. Journal of Biological Chemistry 2011 ;Volum 286.(19) s. 16669-16680 is not included due to copyright. Available at http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M111.230052Paper 2: Galashevskaya, Anastasia; Sarno, Antonio; Vågbø, Cathrine Broberg; Aas, Per Arne; Hagen, Lars; Slupphaug, Geir; Krokan, Hans Einar. A robust, sensitive assay for genomic uracil determination by LC/MS/MS reveals lower levels than previously reported. DNA Repair 2013 ;Volum 12.(9) s. 699-706 http://dx.doi.org/10.1016/j.dnarep.2013.05.002 The article is reprinted with kind permission from Elsevier, sciencedirect.com
Paper 3: Sarno A, Alsøe L, Galashevskaya A, Tekin NB, Jobert L, SenGupta T, Carracedo S, Krokan HE, Nilsen H., UNG and SMUG1 efficiently complement each other in removing genomic uracil from mouse organs
Paper 4: Pettersen, Henrik Sahlin; Galashevskaya, Anastasia; Doseth, Berit; Sousa, Mirta; Sarno, Antonio; Visnes, Torkild; Aas, Per Arne; Liabakk, Nina-Beate; Slupphaug, Geir; Sætrom, Pål; Kavli, Bodil Merete; Krokan, Hans Einar. AID expression in B-cell lymphomas causes accumulation of genomic uracil and a distinct AID mutational signature. DNA Repair 2015 ;Volum 25. s. 60-71 http://dx.doi.org/10.1016/j.dnarep.2014.11.006 The article is reprinted with kind permission from Elsevier, sciencedirect.com