Uracil in DNA - necessary intermediate for antibody maturation and mutagenic lesion

Abstract

Uracil in DNA - et viktig mellomprodukt for adaptiv immunitet og mutagen skade Uracil er en av fire nukleobaser i RNA, men små mengder kan også befinne seg i DNA. Det er to kilder til genomisk uracil: misinkorporering av deoksyuridin trifosfat (dUTP) i steden for deoksytymidin trifosfat (dTTP) under DNA replikasjon, og deaminering av cytosin. dUTP misinkorporering danner uracil:adenin (U:A) par uten konsekvenser for genetisk informasjon. Cytosin deaminering resulterer derimot i uracil:guanin (U:G) par med mutagent potensiale. U:G par har derfor lenge blitt ansett som DNA skade, men i begynnelsen av 2000 tallet ble det etterhvert også klart at activation induced deaminase (AID) drevet cytosin deamineringer startpunktet for antistoffsmodningsprosessene somatisk hypermutasjon (SHM) og klasseskift rekombinajon (CSR). Til tross for sin rolle i det antistoffmodning har sekvensringsekperimenter av kreftgenomer vist at andre cytosin deaminaser (APOBECer) er ansvarlige for mutasjonssignaturer i mange ulike krefttyper. Vårt arbeid har fokusert på uracils tilknytning til kreft og adaptiv immunitet. Mange uracil-relaterte observasjoner kommer fra musemodeller. I artikkel I undersøkte vi derfor aktivitetsnivå og mengde av tre uracilreparerende enzymer UNG2, SMUG1 og TDG i ulike cellelinjer fra menneske og mus. Vi fant at den totale uracilfjerningskapasiteten fra U:A og U:G substrater var større i humane celler enn for museceller, hovedsakelig fordi UNG-nivået var høyere. I museceller stod SMUG1 for 50 % av uracil-fjerningskapasitet fra U:G substrat, men bare 1 % i humane celler. Slike forskjeller er viktige å ta i betraktning når man bruker musemodeller i forskning rettet mot genomisk uracil. Vi stimulerte videre primære B-celler fra mus til å gjennomgå CSR. UNG og SMUG1 aktivitet i de stimulerte B-cellene var på samme nivå som i de øvrige musecellelinjene, hvilket indikerer at både UNG og SMUG1 er uttrykt og kan fjerne U:G fra deaminert cytosiner i aktiverte B-celler. Flere forskningsgrupper har forsøkt å måle genomiske uracilnivåer, men resultatene deres varierte med nesten tre størrelsesordener. De store forskjellene i målte uracilnivåer kan forklares med biologiske ulikheter i prøvene til de ulike gruppene, men vi foreslår at det stammer fra tekniske svakheter i målemetodene. I artikkel II identifiserte vi og løste problemer ved DNA preparasjon som bidro til overvurderingen av uracilnivåer, hovedsakelig fra med-isolert dUMP og in vitro-generert uracil fra cytosindeaminering. Vi presenter en metode for absolutt kvantifisering av genomisk uracil hvor DNA hydrolyseres med enzymer til nucleosider, deoksycytidin fjernes ved væskekromatografi-fraksjonering, og deoxyuridin måles gjennom væskekromatografi-massespektrometri (LC/MS/MS). Vi testet metoden i en relevant biologiske sammenheng ved måling av genomisk uracilnivåer i mus embryonale fibroblaster (MEFer) og humane lymfoblastoide cellelinjer som ikke utrykker UNG. Vi fant at de UNG-manglene cellene inneholdte fem- til elve ganger mer genomisk uracil. Videre observerte vi at UNG-kompetente celler inneholdt 400 til 600 uraciler per genom. Våre uracilmålinger er lavere enn tidligere rapporterte genomisk uracil verdier. Dette indikerer at det basale uracil nivået har blitt overvurdert og at vår metode gir den mest nøyaktige uracil kvantifiseringen. UNG2 er ansett som den viktigste glycosylasen i reparasjon av genomisk uracil, mens SMUG1 fungerer som støtte. I artikkel III studerte vi rollene til de to glycosylasene ved bruk av Ung-/-Smug1-/- mus. Vi observerte at SMUG1i hovedsak står for genomisk 5- hydroxymethyluracil (5-hmU) fjerningsaktivitet i musevev og MEFer, og at Smug1-/- mus akkumulerte 5-hmU. I motsetning til dette hadde SMUG1-status ingen effekt på genomiske uracil nivåer og nesten ingen effekt på uracil fjerningsaktivitet. Fjerningsaktivteten ble kun funnet lavere i Smug1+/- og Smug1-/- hjerneprøver. UNG-mangel reduserte uracil fjerningsaktiviteten i alle vevsprøver bortsett fra hjerne, og Ung-/- mus hadde to- til tre-gang høyere genomiske uracilnivåer enn villtype mus. Vi fant imidlertid en mye større økning, 3- til 20-ganger, av genomiske uracilnivåer i Ung-/-Smug1-/- mus, i tillegg til en komplett ablasjon av uracil fjerningsaktiviteten. Vi forutsetter derfor at UNG er i hovedsak ansvarlig for uracil-fjerningsaktivitet i alle testete vev bortsett fra hjerne med SMUG1 som støtte, og at enten UNG eller SMUG1 er tilstrekkelig for å opprettholde basale nivåer av genomisk uracil. Selv om det er mange bevis for at AID og APOBEC mutasjonssignaturer i kreft stammer fra enzymatisk cytosin deaminering har uracilnivåer ikke ble testet i sammenheng med AID og APOBEC uttrykk. I artikkel IV målte og korrelerte vi derfor genomisk uracil- og AID-nivåer i en rekke ulike B-celle lymfomcellelinjer. Vi fant tydelig korrelasjon mellom genomisk uracil og AID uttrykk i lymfomcellelinjer, og ingen korrelasjon i ikkelymfomcellelinjer. I tillegg økte eller reduserte vi AID nivåer ved AID-overuttrykk, B-celle stimulering og shRNA mediert AID ekspresjonshemming. Vi observerte at AID økning førte til mer genomisk uracil mens AID senking reduserte mengden genomisk uracil. Vi korrelerte genomisk uracil med uracil-DNA glykosylasenivåer, men fant kun svakere korrelasjoner enn med AID uttrykk og kun i ikke-lymfomcellelinjer. Ved repetisjon av sekvenseringsanalysene rettet mot APOBEC mutasjonssignaturer fant vi en AID-spesifikke mutasjonssignatur i Bcelle lymfomer og kronisk lymfatisk leukemi. Vi har dermed påvist at høye AID uttrykk følges av genomisk uracil akkumulering og at dette er assosiert med kreft in vivo. I sum har dette arbeidet bidratt til bedre forståelse av de biologiske egenskapene til genomisk uracil og de proteinene som kontrollerer dets nivåer. Dette har gitt ny innsikt i hvordan uracil prosesseres og hva konsekvensene er ved feilregulering