A novel approach for transcriptomic mapping of cortical astrocytes and neurons upon sustained local noradrenergic neuromodulation
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/3144150Utgivelsesdato
2024Metadata
Vis full innførselSamlinger
Beskrivelse
Full text not available
Sammendrag
Noradrenalin (NA) er en essensiell nevromodulator for normal hjernefunksjon. Den viktigste kilden til noradrenalin (NA) i hjernen er Locus Coeruleus (LC), plassert i hjernestammen. NA frigjøres fra LC-nevroner gjennom både volum og synaptisk transmisjon. Nevromodulasjonen oppnås ved at NA binder seg til ulike adrenerge reseptorer, funnet langs membranen til ulike celler. Både nevroner og gliaceller uttrykker adrenerge reseptorer. Astrocytter og deres ekstrasynaptiske territorier har blitt foreslått som viktige mål for NA-modulasjon i hjernen. På tross av at mange studier har undersøkt effekten av NA på nevronal aktivitet og atferd er det fremdeles uvisst hvordan NA påvirker genuttrykket til nevroner og astrocytter. I dette prosjektet hadde vi som mål å etablere en metode for å aktivere LC-nevroner som hovedsakelig projiserer til somatosensorisk cortex (LC-SC), over en lengre periode. Videre ønsket vi å ta i bruk den nye metoden i kombinasjon med RNA-sekvensering, for å på denne måten undersøke effekten av vedvarende NA-utslipp på genuttrykket til nevroner og astrocytter i SC. For å oppnå dette brukte vi "Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs" (DREADDs) regulert av medikamentet Deschloroclozapine (DCZ) for å aktivere LC-nevroner. For å utelukkende aktivere LC-SC-nevroner brukte vi en Split-Cre-komplementeringsstrategi kombinert med en rAAV-retro serotype. Ved behandling av DCZ vil DRAEDD reseptorer bli eksklusivt aktivert i LC-SC-nevroner, og NA blir frigjort lokalt i SC over en vedvarende periode. Etter DCZ-behandling ble cellekjernene til nevroner og astrocytter fra SC sorter med fluorescens-aktivert cellekjerne sortering (FANS). Videre ekstraherte vi RNA fra de sorterte cellekjernene for å kunne sende det til RNA-sekvensering. Samtidig etablerte vi også protokoller for RNA ekstrahering av hele nevroner og astrocytter basert på introduksjonen av gener via rAAV vektorer samt fluorescens-aktivert cellesortering (FACS), i ubehandlede villtype mus. I dette prosjektet etablerte vi en ny metode for å oppnå spesifikk aktivering av distinkte LC-SC-nevroner. I tillegg utviklet vi også prosedyrer for å klargjøre RNA fra cellekjerner og hele celler av nevroner og astrocytter for RNA-sekvensering. Til slutt utførte vi innledende dataanalyse av sekvenseringsdata fra nevroner og astrocytter sortert med FACS, hvor vi avdekket interessante genuttrykk. Noradrenaline (NA) is an important neuromodulator for normal brain function. The main noradrenergic output originates from Locus Coeruleus (LC), situated in the brainstem. NA is released from LC neurons through both volume and synaptic transmission. The neuromodulation is achieved by the binding of NA to a series of adrenergic receptors, located in the membrane of cellular targets. Both the neurons and glia express adrenergic receptors. Astrocytes and their extrasynaptic compartments have been proposed as the main cellular target for NA modulation. Although effects of NA on neuronal activity and behaviour have been extensively studied, how NA is effecting on transcriptome levels of its targeted neurons and astrocytes remained unclear. Here, I aimed to establish a method to activate LC neurons mainly projecting to somatosensory cortex (LC-SC) over a longer period of time, mimicking sustained NA release in SC. I next aimed to use this method in combination with RNA sequencing to investigate the effect of sustained NA release on changes of the transcriptome in neurons and astrocytes in SC. To achieve this, I used “Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs” (DREADDs) and the corresponding designer drug Deschloroclozapine (DCZ) to activate LC neurons. To target distinct LC-SC neurons, a Split-Cre complementation strategy combined with rAAV-retro serotype was used. Upon DCZ treatment, DRAEDDs activated LC-SC neurons, leading to a sustained local NA release in SC. Following DCZ treatment, neuronal and astrocytic nuclei were sorted by fluorescence activated nuclei sorting (FANS) and RNA were extracted for RNA sequencing. In addition, protocols for extracting RNA from full neurons and astrocytes were established using rAAV gene delivery method and fluorescence activated cell sorting (FACS) in wild type untreated animals. Taken together, in this project, I establish a novel approach for targeting and activating distinct LC-SC neurons. I also develop procedures for preparing both nuclear and whole cell RNA from neurons and astrocytes for RNA sequencing. Lastly, I performed a preliminary data analysis on transcriptome data from neurons and astrocytes sorted by FACS, which has revealed interesting gene expression patterns.