Overexpression of miR-210 rescues human cardiomyocytes from doxorubicin-induced stress

Abstract

Bakgrunn: Fremskritt i tidlig diagnostikk og behandling av kreftsykdommer har ført til en økning i antall pasienter som overlever kreft. Denne økningen har samtidig ført til at stadig flere pasienter lever med helseproblemer forårsaket av selve behandlingen. Kjemoterapi-indusert hjertesykdom utgjør et slikt problem, og doxorubicin er et av legemidlene som er mest beryktet for å forårsake hjertetoksisitet. Dette legemidlet er mye brukt i behandling av kreftsykdommer som brystkreft, lymfom og kreft hos barn. Bruken er forbundet med akkumulativ doseavhengig hjertetoksisitet, som fører til kardiomyopati, en tilstand som kan utvikle seg til hjertesvikt. MikroRNA, oppdaget for drøyt 30 år siden, spiller en avgjørende rolle i reguleringen av gennettverk og modifiseringen av komplekse biologiske prosesser. Et slikt mikroRNA, miR-210, promoterer overlevelsen til en rekke celletyper under hypoksi. Tilgjengelige strategier for å håndtere doxorubicin-indusert hjertesykdom er i dag utilstrekkelige, og miR-210 har vist lovende resultater i både in vitro- og in vivo-studier av iskemisk hjertesykdom. Dermed var formålet med denne oppgaven å studere effektene av miR-210 på celledød, celleviabilitet og apoptose i humane AC-16 hjertemuskelceller. I tillegg utforskes Akt-GSK-3β-signalveien i forbindelse med apoptose.

Metoder: miR-210 ble oppregulert og nedregulert i AC-16 hjertemuskelceller ved bruk av midlertidige overuttrykks- eller inhibitoriske transfeksjonsvektorer før cellene ble behandlet med 5 µM doxorubicin i 24 timer. Generell celledød ble studert gjennom en laktatdehydrogenase (LDH)-release assay, mens celleviabilitet ble studert gjennom en MTT-assay. Apoptotisk celledød ble studert ved hjelp av en caspase-3 activity assay, og Akt-GSK-3β-signalveien ble utforsket ved bruk av en sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-tilnærming. I tillegg ble det utført et in silico-søk for å identifisere mulige miR-210-målgener som kunne fungere som en forbindelse til Akt-GSK-3β-signalveien.

Resultater: Oppregulering av miR-210 i AC-16 hjertemuskelceller eksponert for 24 timer doxorubcinbehandling forårsaket en signifikant reduksjon i generell celledød (p < 0,001), en signifikant økning i celleviabilitet (p < 0,05) og en signifikant reduksjon i apoptotisk celledød (p < 0,0001). Nedregulering av miR-210 i AC-16 hjertemuskelceller eksponert for de samme eksperimentelle betingelsene resulterte i en signifikant økning i generell celledød (p < 0,0001) og i apoptotisk celledød (p < 0,0001), men ingen effekt på celleviabiliteten ble observert. En økning i både p-Ser9 GSK-3β (p < 0,0001) og p-Ser473 Akt (p < 0,01) ble observert i gruppen hvor miR-210 var oppregulert, mens en nedgang i p-Ser473 Akt (p < 0,5) ble observert i gruppen hvor miR-210 var nedregulert. Ingen endring i p-Ser9 GSK-3β ble observert i denne gruppen. KMT2D, RAP2B, EFNA3, E2F3, ATG7, BDNF og HIF3A ble identifisert som mulige målgener for miR-210 med en eksperimentelt bestemt forbindelse til Akt.

Konklusjon: miR-210 utøver cellebeskyttende effekter i AC-16 hjertemuskelceller utsatt for 24 timer med doxorubicinbehandling. Disse effektene skyldes redusert celledød, økt celleviabilitet og redusert apoptose. Reduksjonen i apoptose medieres gjennom modulering av Akt-GSK-3β-signalveien. Dermed foreslås det i denne oppgaven en ny rolle for miR-210 i å redusere doxorubicin-indusert celledød i hjertemuskelceller, og fremhever dets potensial som et terapeutisk mål.

Background: Diagnostic and treatment-related improvements in cancer management have led to an increase in patients surviving their malignant diseases. This increase has been accompanied by a rise in survivors experiencing treatment-induced health issues. Chemotherapy-induced cardiac damage constitutes one such problem, and doxorubicin is one of the most notorious cardiotoxic anticancer drugs. This drug is widely used for cancers such as breast cancer, lymphoma, and childhood cancers. Its usage is associated with cumulative dose-dependent cardiotoxicity, leading to cardiomyopathy and, eventually, congestive heart failure. Moreover, since their discovery just over 30 years ago, microRNAs have been described as key players in the regulation of gene networks and in modifying complex biological processes. One such microRNA, miR-210, promotes the survival of numerous cell types under hypoxic conditions. Current prevention strategies of managing doxorubicin-cardiac damage are insufficient, and miR-210 have shown promising results in both in vitro and in vivo studies of ischemic cardiac disease. As such, this thesis studies the effects of miR-210 on cell death, cell viability, and apoptosis in human AC-16 cardiomyocytes. In addition, the Akt-GSK-3β signaling pathway was explored in relation to apoptosis.

Methods: miR-210 was upregulated or downregulated in AC-16 cardiomyocytes using transient expression or decoy/inhibitory transfection vectors before being subject to 5 µM doxorubicin treatment for 24 hours. General cell death was determined using a lactate dehydrogenase (LDH)-release assay, while cell viability was examined using an MTT assay. Apoptotic cell death was determined by a caspase-3 activity assay, and the Akt-GSK-3β signaling pathway was explored using a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) approach. Additionally, an in silico search was performed to identify potential miR-210 target genes serving as a link to the Akt-GSK-3β signaling pathway.

Results: Upregulation of miR-210 in AC-16 cardiomyocytes exposed to 24 hours doxorubicin treatment caused a significant reduction in general cell death (p < 0.001), a significant increase in cell viability (p < 0.05), and a significant reduction in apoptotic cell death (p < 0.0001). Downregulation of miR-210 in AC-16 cardiomyocytes exposed to the same conditions resulted in a significant increase in general cell death (p < 0.0001) and in apoptotic cell death (p < 0.0001), while no effect on cell viability was observed. An increase in both p-Ser9 GSK-3β (p < 0.0001) and p-Ser473 Akt (p < 0.01) was observed in the miR-210-upregulated group, while a decrease in p-Ser473 Akt (p < 0.5) but no difference in p-Ser9 GSK-3β was observed in the miR-210-downregulated group. KMT2D, RAP2B, EFNA3, E2F3, ATG7, BDNF, and HIF3A were identified as the potential miR-210 target genes having an experimentally determined link to Akt.

Conclusion: miR-210 exerts cytoprotective effects in AC-16 cardiomyocytes exposed to 24 hours of doxorubicin treatment by reducing cell death, increasing cell viability, and inhibiting apoptosis through modulation of the Akt-GSK-3β signaling pathway. Thus, this thesis suggests a novel role of miR-210 in mitigating DOX-induced cardiomyocyte death, highlighting its potential as a therapeutic target.