Multiple myeloma bioenergetics: Mitochondrial uncoupling in malignant plasma cells & its effects on PRL-3 in acidic and hypoxic tumor microenvironment

Abstract

Myelomatose er en type blodkreft som påvirker B-lymfocytter i benmargen (BM), og stammer fra kroppens plasmaceller som produserer antistoffer. Et kjennetegn ved kreftceller er omstilling av metabolismen mot aerob glykolyse, en fenomen der kreftceller foretrekker glykolyse over oksidativ fosforylering for å produsere ATP, selv i nærvær av tilstrekkelig oksygen. Mikromiljøet i beinmargen er komplekst, og kjennetegnes av sur pH og lavt oksygennivå, noe som er avgjørende for å forme kreftcellenes metabolisme, og i å fremme tumorutvikling. PRL-3, en metastase-assosiert fosfatase, er en viktig del av myelomatoses evne til å endre metabolismen, samt at det beskytter kreftcellene mot det sure miljøet i mikromiljøet.

I denne studien undersøkte vi effekten av avkoblerne BAM15 og CCCP, og glykolysinhibitoren 2-Deoxy-D-Glukose (2-DG) på energiproduksjon i INA-6 myelomatose (MM) celler. Avkoblere forstyrrer elektrontransportkjeden og ATP-syntese ved å transportere H+-ioner fra den mitokondrielle intermembranen til matrix, og kollapser dermed den elektrokjemiske gradienten som er nødvendig for å drive ATP-syntase. 2-DG, en glukoseanalog uten en kritisk OH-gruppe, akkumuleres under den første fasen av glykolysen, og blokkerer glukosemetabolismen og dermed reduserer ATP produksjon via glykolysen. I denne studien så var vårt mål å oppklare effekten av disse stoffene på å forstyrre metabolske prosesser som er avgjørende for kreftcellers overlevelse, med fokus på PRL-3s rolle og effektene av metabolsk acidose og hypoksi. Tidligere studier har vist at kreftceller som uttrykker PRL-3, har økt produksjon av ATP, og oppregulerer både oksidativ fosforylering og glykolyse sammenlignet med kontrollceller, noe som antyder en potensiell sårbarhet for målrettet behandling.

Våre funn indikerer at kreftceller som uttrykker PRL-3, viser forbedrede respiratoriske og glykolytiske aktiviteter, som dokumenteres ved økt oksygenforbruk og ekstracellulære acidifikasjonsrater. Ettersom hypoksi vanligvis fremmer glykolyse mens metabolsk acidose hemmer det, undersøkte vi samspillet mellom disse faktorene. Interessant nok opprettholdt PRL-3-celler lignende eller høyere nivåer av proliferasjon og levedyktighet under hypoksi og lav pH når de kun ble eksponert for avkoblere. Denne trenden ble reversert ved introduksjon av 2-DG, og endret betydelig levedyktigheten til PRL-3-uttrykkende celler, noe som understreker glukoseavhengighet som en potensiell svakhet.

Vi vurderte uttrykkene av viktige proteiner involvert i metabolisme og tilpasning til hypoksi og lav pH. Våre resultater viste at p-AMPK i PRL-3-celler hadde paradoksalt nok nedregulering under forhold som energistress, og at uttrykket av GLUT1 var lavere i celler som uttrykker PRL-3 ved både pH 7.4 og pH 6.5 sammenlignet med kontrollcellene, men mer under normoksiske forhold enn hypoksiske forhold. I tillegg, ved høyere doser av avkoblere, var uttrykket av HIF-1α nesten fullstendig nedregulert, med en mer påvist effekt sett i PRL-3-celler. Videre ble det vist at PRL-3 induserte en Warburg-effekt uavhengig av HIF-1α under normoksiske forhold, og demonstrerer ytterligere dens betydning i metabolsk omstilling i MM-celler.

Til slutt ble membranpotensial og superoksidproduksjon undersøkt etter behandling med avkobler. CCCP reduserte mitokondriell membranpotensial doseavhengig i både Mock- og PRL-3-celler, med en sterkere innvirkning observert i PRL-3-celler. Selv om CCCP induserte en økning i superoksidproduksjon, spesielt ved høye konsentrasjoner, viste ikke BAM15 en lignende effekt. Vi observerte at PRL-3 forsterket basal superoksidproduksjon i cellene, samtidig som det ga dyktighet mot ytterligere økninger indusert av avkoblerne.

Multiple myeloma is a type of hematologic cancer that affects B lymphocytes in the bone marrow BM, originating from the antibody-producing plasma cells of the body. A hallmark of cancer cells is the rewiring of metabolism toward aerobic glycolysis, a phenomenon in which cancer cells favor glycolysis over oxidative phosphorylation to produce ATP, even in the presence of sufficient oxygen. The tumor microenvironment is complex, characterized by acidic pH and low oxygen levels, which are crucial in shaping cancer cell metabolism and promoting tumor progression.

Phosphatase of regenerating liver-3 (PRL-3), a metastasis-associated phosphatase, has emerged as a key regulator of cancer cell metabolism, orchestrating metabolic adaptations to support tumor growth and survival amid these harsh conditions. In this study, we investigated the impact of the uncoupling agents BAM15 and CCCP, and the glycolysis inhibitor 2-Deoxy-D-Glucose (2-DG) on energy production in INA-6 multiple myeloma (MM) cells. Mitochondrial uncouplers disrupt the electron transport chain and ATP synthesis by transporting H+ ions from the intermembrane space to the mitochondrial matrix, thereby collapsing the electrochemical gradient necessary for powering ATP synthase. 2-DG, a glucose analog lacking a critical hydroxyl group, accumulates during the initial phase of glycolysis, competitively blocking glucose metabolism and thus diminishing glycolytic energy output.

Our objective was to elucidate the efficacy of these compounds in disrupting metabolic pathways crucial for cancer cell survival, with a focus on the role of PRL-3 and the effects of metabolic acidosis and hypoxia. Previous studies have demonstrated that PRL-3-expressing cancer cells exhibit increased ATP production, upregulating both OXPHOS and glycolysis compared to control cells, suggesting a potential vulnerability in targeting energy production.

Our findings indicate that PRL-3-expressing cancer cells display enhanced respiratory and glycolytic activ- ities, as evidenced by increased oxygen consumption and extracellular acidification rates. Given that hypoxia typically promotes glycolysis while metabolic acidosis inhibits it, we investigated the interplay of these factors. Interestingly, PRL-3 cells maintained similar or higher levels of proliferation and viability under hypoxia and low pH when exposed solely to uncoupling agents. However, the introduction of a glycolysis inhibitor reversed this trend, substantially altering the viability of PRL-3-expressing cells, highlighting glucose addiction as a potential weakness.

We assessed the expression of key proteins involved in metabolism and adaptation to hypoxia and low pH. Our results showed that p-AMPK in PRL-3 cells exhibited paradoxical downregulation under conditions of energy stress induced by shutting down ATP production, and that the expression of GLUT1 was lower in cells expressing PRL-3 at both pH 7.4 and pH 6.5 compared to Mock cells, but more so under normoxic than hypoxic conditions. Additionally, at higher doses of uncoupling agents, the expression of HIF-1α was almost completely abolished, with a more pronounced effect seen in PRL-3 cells. Furthermore, PRL-3 was shown to trigger a Warburg effect independent of HIF-1α under normoxic conditions, further demonstrating its significance in metabolic rewiring in MM cells.

Lastly, mitochondrial membrane potential and superoxide production were examined following treatment with uncouplers. CCCP decreased mitochondrial membrane potential dose-dependently in both Mock and PRL-3 cells, with a stronger impact observed in PRL-3 cells. Although CCCP induced an increase in superoxide production, particularly at high concentrations, BAM15 did not exhibit a similar effect. We observed that PRL-3 enhanced basal superoxide production in cells, while also conferring resistance to further increases induced by uncouplers.