Effects of Deucravacitinib in Intestinal Epithelial Cells

Abstract

Bakgrunn: Inflammatorisk tarmsykdom (IBD), inkludert Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, referer til en gruppe kroniske medisinske lidelser som forårsaker vedvarende betennelse i mage-tarmkanalen. Den eksakte årsaken til IBD er ukjent, men det antas å skylde en upassende immunrespons mot tarmens mikrobiota, fremmet av den genetiske disposisjonen til individet. Tarmens epitelceller (IEC) gir en fysisk barriere og opprettholder tarmens homeostase, noe som er viktig for en sunn tarm. Tilheling av tarmslimhinnen (remisjon) er et terapeutisk mål, men det mangler effektive medikament som kan gjenopprette tilheling av tarmslimhinnen på grunn av kompleksiteten til sykdommen. Janus kinase-signal transduserer- og aktivator av transkripsjonsprotein (JAK-STAT) signaleringsveien driver en rekke fysiologiske og patologiske prosesser som proliferasjon, metabolisme og immunrespons. Interferoner (IFN) aktiverer JAK-STAT signaliseringsveien og spiller en rolle i inflammatoriske lidelser. Tre JAK-hemmere, Tofacitinib, Filgotinib og Upadacitinib, er godkjent for bruk hos IBD-pasienter, og det er nye tyrosinkinase 2-hemmere (TYK2), Brepocitinib or Deucravacitinib, i klinisk testing. Det er ennå uklart hvordan disse medikamentene påvirker epitelceller, men å undersøke hvordan disse legemidlene virker på cellulært nivå kan øke forståelsen vår av hvordan de kan fremme tilheling av tarmslimhinnen.

Mål: Hovedmålet med denne masteroppgaven er å få ytterligere innsikt i hvordan TYK2-hemmer Deucravacitinib forhindrer JAK-STAT signalisering i kolonepitelceller. Spesifikt vil vi evaluere: 1) om aktivering av TYK2 er forskjellig ved stimulering med IFN-β, -γ, og -λ1; 2) om Deucravacitinib forhindrer fosforylering av TYK2, og videre hemmer aktivering av STAT1 og STAT3; 3) om IFN-β, -γ, og -λ1 har ulik effekt på kjemokin-utskillelse fra kolonepitelceller og 4) om Deucravacitinib påvirker interferon-indusert kjemokinfrigjøring av CXCL1 og CXCL11.

Metoder: Human kreftcellelinje fra tykktarmen, HT-29, og organoider fra tykktarmsepitel (kolonoider) fra friske kontroller og pasienter med ulcerøs kolitt ble brukt som ex vivo modellsystemer for kolonepitelceller i fire serier av forsøk. I forsøksserie nr. 1, ble HT-29 celler stimulert med IFN-β, -γ, og -λ1 for 15 minutter og 2 timer før deteksjon av aktivert TYK2 med Western blot. Videre ble HT-29 celler behandlet med 5 ulike doser av Deucravacitinib i forsøksserie nr. 2, og den medikamenthemmende effekten på TYK2, STAT1, og STAT3 ble analysert ved bruk av Western blot. Basert på resultatene fra doseserien i HT-29 celler, ble kolonoider fra en frisk donor brukt i forsøksserie nr. 3 for å bekrefte Deucravacitinibs hemmende effekt på TYK2, STAT, og STAT3 i en fysiologisk relevant IBD modell. I forsøksserie nr. 4 ble kolonoider fra tre forskjellige donorer forbehandlet med Deucravacitinib og fire andre JAK-hemmere (Brepocitinib, Filgotinib, Upadacitinib, og Tofacitinib), for å studere deres effekt på IFN-indusert kjemokinfrigjøring ved bruk av enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Resultater: I HT-29 celler, førte IFN-β til mest fosforylering av TYK2 sammenlignet med IFN-λ1 og -γ, og denne aktiveringen var størst ved 15 minutt sammenlignet med 2 timer. Forbehandling med Deucravacitinib viste signifikant hemming av IFN-β og -λ1 indusert aktivering av TYK2, STAT1 og STAT3 i både HT-29 celler og kolonoider. IFN-γ induserte mest frigjøring av CXCL1 og CXCL11 i humane kolonoider sammenlignet med IFN-β og -λ1. Deucravacitinib viste signifikant inhibering av IFN-β og IFN-γ indusert CXCL11 frigjøring fra humane kolonoider.

Konklusjon: Resultatene i denne oppgaven viser at en spesifikk TYK2-hemmer Deucravacitinib kunne regulere IFN indusert JAK-STAT signalisering i humane kolonepitelceller. Effektene var hovedsakelig på IFN-β og -λ1 stimulering, men selv ved IFN-γ stimulering som signaliserer via JAK1 og JAK2, ble det observert en betydelig hemming av STAT3 og CXCL11 frigjøring av Deucravacitinib. Mer informasjon om de cellulære effektene av type I, II og III IFN og JAK-hemmere i kolonepitelceller er nødvendig for å avgjøre om medikamentet som er ment mot immunceller har ønskede eller ugunstige effekter på tarmens epitellag.

Background: Inflammatory bowel disease (IBD), including Crohn’s disease and ulcerative colitis, refers to a group of chronic medical disorders that cause persistent inflammation of the gastrointestinal tract. The exact cause of IBD is unknown, but it is thought to result from an inappropriate immune response to gut microbiota, catalyzed by the genetic susceptibility of the individual. The intestinal epithelial cells (IECs) provide a physical barrier and maintain intestinal homeostasis which is important for a healthy gut. Mucosal healing is a current therapeutical goal, but there is a lack of broadly effective therapeutics that can restore mucosal healing due to the complexity of the disease. The Janus kinase-signal transducer and activation of transcription (JAK-STAT) signaling pathway mediates cellular inflammation responses and drives a series of physiological and pathological processes such as proliferation, metabolism, and immune response. Interferons (IFN) are activators of the JAK-STAT signaling pathway and play a role in inflammatory disorders. Three JAK inhibitors Tofacitinib, Filgotinib, and Upadacitinib, are approved for use in IBD patients, and there are new emerging tyrosine kinase 2 (TYK2) inhibitors, Brepocitinib and Deucravacitinib in clinical testing. It is yet unclear how these medications affect IECs, but examining how these drugs work on a cellular level can increase our understanding of how they may promote mucosal healing.

Objectives: The aim of the study was to investigate how the intestinal epithelium responds to the emerging TYK2-inhibitor Deucravacitinib. Specific objectives are to evaluate: 1) if IFNs type I-III (IFN-β, -γ, and -λ1) differ in the activation of TYK2 in IECs; 2) if Deucravacitinib affects phosphorylation of TYK2, and thereby inhibit IECs activation of STAT1 and STAT3; 3) if IFN-β, -γ, and -λ1 differ in the induction of chemokine release from IECs; and 4) if Deucravacitinib affects the IFNs induced chemokine release of CXCL1 and CXCL11 from IECs.

Method: The human colonic cancer cell line HT-29 and colonic epithelial organoids (colonoids) from patients with ulcerative colitis and healthy control donors were used as ex vivo model systems for IECs in four series of experiments. In experimental series no. 1, HT-29 cells were stimulated with IFN-β, -γ, and -λ1 for 15 minutes and 2 hours before the detection of activated TYK2 by Western Blot. Furthermore, HT-29 cells were pre-treated with five different doses of Deucravacitinib in experimental series no. 2, and the drugs inhibitory effect on TYK2, STAT1, and STAT3 was analyzed using Western Blot. Based on the dose-series results in HT-29 cells, colonoids from one healthy donor were used in experimental series no. 3, to confirm Deucravacitinib inhibitory effect on TYK2, STAT1, and STAT3 in a physiologically relevant IBD model. In the fourth series of experiments, colonoids from three different donors were pre-treated with Deucravacitinib and four other JAK-inhibitors (Brepocitinib, Filgotinib, Upadacitinib, and Tofacitinib), to study their effects on IFNs induced chemokine release by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysis of CXCL1 and CXCL11 in conditioned medium.

Results: In HT-29 cells, IFN-β induced the most phosphorylation of TYK2 compared to IFN-λ1 and -γ, and this activation peaked at 15 minutes compared to 2 hours. Pre-treatment with Deucravacitinib showed significant inhibition of IFN-β and -λ1 induced activation of TYK2, STAT1, and STAT3 in both HT-29 cells and colonoids. IFN-γ induced the most release of CXCL1 and CXCL11 in human colonoids compared to IFN-β and -λ1. Deucravacitinib showed significant inhibition of IFN-β and -γ induced CXCL11 release from human colonoids.

Conclusion: Results in this thesis demonstrate that the specific TYK2 inhibitor Deucravacitinib could regulate IFN induced JAK-STAT signaling in human colonic epithelial cells. The effects were mainly on IFN-β and -λ1 stimulation, but even on IFN-γ stimulation which signals via JAK1 and JAK2, there was observed a significant inhibition of STAT3 and CXCL11 release by Deucravacitinib. Furthermore, Brepocitinib, Tofacitinib, Filgotinib, and Upadacitinib showed significant inhibition of IFNs induced CXCL11 release from colonoids. More details regarding the cellular effects of type I, II, and III IFNs and JAK-inhibitors in IECs are needed to determine whether drugs intended to target immune cells have desired or adverse effects on the intestinal epithelium.