Effects of JAK inhibitor Brepocitinib on Intestinal Epithelial Cells

Abstract

Bakgrunn og mål: Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) inkluderer en gruppe kroniske inflammatoriske lidelser som påvirker fordøyelseskanalen. Tarmepitelceller spiller en viktig rolle i opprettholdelsen av homeostasen i tarmen og dermed også utviklingen av IBD da de formidler signaler mellom mikrobiota i lumen og immuncellene i lamina propria. Ettersom IBD-patogenesen involverer en dysregulering i produksjonen av inflammatoriske cytokiner, hvorav mange er avhengige av Janus kinase (JAK)-signalveier for videreføring, inkludert forskjellige interferoner (IFN), har JAK hemmere vist seg å være et lovende behandlingsalternativ for IBD. JAK-hemmere er små molekyler som fungerer ved å hemme ulike JAK-enzymer og deres nedstrøms signaleringsmolekyler. Siden tilgjengelig behandling for IBD nesten utelukkende har blitt testet på immunceller, var det overordnede målet med denne oppgaven å undersøke effektene av JAK1/TYK2 hemmeren Brepocitinib i tarmepitelceller ved å undersøke om JAK- signal transduser og aktivator av transkripsjonsprotein (STAT)-veien og kjemokinfrigjøring i tarmepitelceller var forskjellig avhengig av hvilken type IFN som ble brukt for stimulering, IFN-β, -γ eller -λ1 med og uten forbehandling med JAK-hemmere.

Metode: For å evaluere effekten av JAK hemmeren Brepocitinib på fosforylering av tyrosinkinase 2 (TYK2), STAT1 og STAT3-proteiner etter behandling, samt utskillelsen av kjemokinene CXCL1 og CXCL11 sammenlignet med andre JAK hemmere (Deucravacitinib, Tofacitinib, Filgotinib og Upadacitinib), ble humane kreftceller HT29 og kolonoider stimulert med IFN-er. Western blot analyse ble utført for å detektere endringer i fosforyleringsnivåene, mens enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ble brukt til å kvantifisere utskillelsen av CXCL1 og CXCL11 fra kolonoider.

Resultater: Fosforyleringen av TYK2, STAT1 og STAT3 ble oppregulert etter behandling med alle tre IFN-ene både i HT29-celler og kolonoider. IFN-β induserte mest fosforylering av TYK2 og STAT3, mens IFN-γ induserte mer fosforylering av STAT1. Den IFN induserte fosforyleringen av STAT1 og STAT3 ble betydelig redusert etter forbehandling med Brepocitinib. Interessant nok økte legemidlet fosforyleringen av TYK2 ved lave doser. Vi observerte også en økning i utskillelsen av CXCL11 fra kolonoider stimulert med IFN-er, som ble hemmet ved forbehandling med høye doser av JAK hemmerene. IFN-γ induserte mest utskillelse av kjemokiner etterfulgt av IFN-β. Verken IFN-ene eller noen av JAK hemmerne hadde noen effekt på utskillelsen av CXCL1.

Konklusjon: Observasjonene presentert i denne oppgaven indikerer at IFN-er varierer i deres aktivering av JAK-STAT-signalveien og induksjon av kjemokinfrigivelse, og at JAK hemmere som Brepocitinib, har ulike effekter på tarmepitelceller basert på dosen. Ytterligere undersøkelser av mekanismen til JAK hemmere i tarmepitelceller er nødvendig for å oppnå en fullstendig forståelse av deres effekter på tarmepitelceller og konsekvensene av å hemme spesifikke deler av JAK-STAT-signalveien.

Background and aims: Inflammatory Bowel Disease (IBD) refers to a group of chronic inflammatory disorders affecting the gastrointestinal tract. Central to the cause of IBD are intestinal epithelial cells (IECs), which serve as crucial mediators between the luminal microbiota and immune cells within the lamina propria. Given that IBD pathogenesis involves the dysregulated production of inflammatory cytokines, many of which rely on Janus kinase (JAK)-signaling pathways for transmission, such as interferons (IFNs), JAK inhibitors hold significant potential in reducing inflammation and restoring intestinal homeostasis. JAK inhibitors are small molecules that function by inhibiting various JAK enzymes and their downstream signaling molecules. Since available treatments used for IBD have almost exclusively been tested on immune cells, the overall aim of this thesis was to investigate the effects of the JAK1/TYK2 inhibitor Brepocitinib in IECs by examining if the JAK- signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway and chemokine release in IECs differed based on the type of IFN stimulation, IFN-β, -γ or -λ1 with and without pre-treatment with JAK inhibitors.

Method: To assess the effects of JAK inhibitor Brepocitinib on the phosphorylation of Tyrosine kinase 2 (TYK2), STAT1, and STAT3 proteins, as well as the secretion of chemokines CXCL1 and CXCL11 compared with additional JAK inhibitors (Deucravacitinib, Tofacitinib, Filgotinib, and Upadacitinib), a human cancerous cell line HT29 and patient-derived colonoids were pre-treated with JAK inhibitors and stimulated with IFNs. Western blot analysis was performed to detect changes in protein phosphorylation levels, while enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was utilized to quantify the secretion of CXCL1 and CXCL11 from colonoids.

Results: The phosphorylation of TYK2, STAT1 and STAT3 was upregulated after treatment with all three IFNs in both HT29-cells and colonoids. IFN-β induced the most phosphorylation of TYK2 and STAT3, whilst IFN-γ induced more phosphorylation of STAT1. IFN-λ1 generally induced the least phosphorylation out of the three IFNs. The IFN induced phosphorylation of STAT1 and STAT3 significantly decreased after pre-treatment with Brepocitinib in a dose-dependent matter. Interestingly, the drug increased the phosphorylation of TYK2 at low doses. We also observed an increase in CXCL11 secretion from colonoids stimulated with IFNs, which was inhibited with pre-treatment by JAK inhibitors at high concentrations. IFN-γ was the most potent inducer of chemokine release, followed by IFN-β. Neither the IFNs nor any of the JAK inhibitors had any effect on the release of CXCL1.

Conclusion: Observations presented in this thesis indicate that IFNs differ in their activation of the JAK-STAT pathway and induction of chemokine release and that JAK inhibitors like Brepocitinib, have different effects on IECs based on the dose. Additional investigation into the mechanisms underlying JAK inhibitors in IECs is necessary to fully understand their effects on IECs and the consequences of inhibiting specific parts of the JAK-STAT pathway.