The Cardioprotective Role of Extracellular Vesicles (EVs) in Remote Ischemic Conditioning (RIC)

Abstract

Bakgrunn: Akutt hjerteinfarkt (AMI) er blant de ledende dødsårsakene globalt, og dødeligheten forventes å fortsatt stige det neste tiåret ifølge Verdens Helseorganisasjon (WHO). Det er derfor viktig å ytterligere forbedre dagens standard AMI-behandlingsstrategier som utgjør trombolytisk terapi og revaskulariserings-teknikker for å redusere iskemisk skade og bevare hjertefunksjonen. For å redusere myokardskaden, legges det ned økt innsats for å utvikle nye farmakologiske tilleggsbehandlinger som tar sikte på å øke toleransen mot iskemi-indusert stress hos pasienter som gjennomgår AMI.

Mål: Det første målet var å etablere en in vitro RIC-modell i Girardi hjerteceller ved å overføre media fra iskemisk prekondisjonerte donor celler (IPCdonor) til naive celler. Det andre målet var å bekrefte om hjerte-beskyttelsen ble mediert av ekstracellulære vesikler (EVs) ved å hemme deres biogenese, frigjøring eller opptak. Det tredje målet var å etablere en oppkonsentreringsprotokoll ved bruk av spinnkolonner for å øke EVs-konsentrasjonen og forbedre deteksjonseffektiviteten i det innsamlede IPCdonor-mediet. Det fjerde målet var å bekrefte tilstedeværelsen av EVs i media samlet inn fra IPCdonor-gruppen ved immunblotting.

Metoder: Tre ulike metoder ble brukt; (1) en in vitro-modell for iskemisk fjernkondisjonering (RIC), (2) spinnkolonner for å oppkonsentrere humorale mediatorer (EVs), og (3) immunblotting for å bestemme tilstedeværelsen av EVs i RIC-modellen.

Resultater: RIC-modellen ble etablert, og bekreftet hjerte-beskyttelse i naive celler behandlet med IPCdonor-media. Hjerte-beskyttelse ble avskaffet ved bruk av inhibitorer av EVs biogenese, frigjøring eller opptak. I tillegg var det en signifikant økning i EVs-tilstedeværelse i media samlet inn fra IPCdonor-gruppen sammenlignet med de tilsvarende kontrollgruppene.

Konklusjon: Resultatene våre bekrefter etablering av en in vitro RIC-modell i humane hjerteceller, siden media samlet fra IPCdonor celler ga hjerte-beskyttelse når det ble overført til fjerntliggende naive celler. Inhibitorer av EVs-biogenese/frigjøring eller EV-opptak bekrefter også involvering av EVs i mediering av RIC-indusert beskyttelse. Immunoblotting påviste også tilstedeværelsen av EVs i det RIC-medierende media samlet inn fra IPCdonor celler, noe som ga ytterligere bevis til EVs som mulige humorale mediatorer for den beskyttelsen som fjernkondisjonering medierer.

Background: Acute myocardial infarction (AMI) is among the leading causes of death globally, and the mortality rates are still expected to rise in the next decade according to the World Health Organization (WHO). It is therefore important to further improve today’s standard AMI treatment strategies constituting of thrombolytic therapy and revascularization techniques to reduce ischemic injury and preserve cardiac function. To circumvent the myocardial injury, enhanced effort is put into developing new adjunct pharmacological treatments aimed at enhancing myocardial tolerance against ischemia induced stress in patients undergoing AMI.

Aims: The first aim was to establish an in vitro RIC model in human cardiac derived Girardi cells by transferring medium from ischemic preconditioned donor Girardi cells (IPCdonor) to naïve cells. The second aim was to confirm whether the cardioprotection in the RIC model was mediated by extracellular vesicles (EVs) by inhibiting their biogenesis, release or uptake. The third aim was to establish a new upconcentrating protocol using spin columns to enhance EVs concentration and improve detection efficacy in the collected IPCdonor medium. The fourth aim was to confirm the presence of EVs in medium collected from the IPCdonor group by immunoblotting.

Methods: Three distinct methods were applied; (1) an in vitro model of remote ischemic conditioning (RIC), (2) spin columns to upconcentrate humoral mediators (EVs), and (3) immunoblotting to determine the presence of EVs in the RIC model.

Results: The RIC model was established, confirming cardioprotection in naïve Girardi cells treated with IPCdonor medium. Cardioprotection was abolished when applying inhibitors of EVs biogenesis, release or uptake. In addition, there was a significant increase in EVs presences in the medium collected from the IPCdonor group as compared to the corresponding control groups.

Conclusion: Our results confirm establishment of a true in vitro RIC model in human cardiac derived Girardi cells, as medium collected from IPCdonor cells conferred cardioprotection when transferred to remote naïve cells. Applying inhibitors of EVs biogenesis/release or EVs uptake also confirm involvement of EVs in mediating RIC induced protection. Immunoblotting also proved presences of EVs in the RIC mediating medium collected from IPCdonor cells, lending further evidence to EVs as potential humoral mediators and inducers of the protection afforded by remote conditioning.