Generation and Characterization of Induced Pluripotent Stem Cells from Individuals Affected by Metachromatic Leukodystrophy

Abstract

Metakromatisk leukodystrofi (MLD) er en ødeleggende lysosomal avleiringssykdom (LSD) forårsaket av mangel på enzymet arylsulfatase A (ARSA). Dette enzymet spiller en avgjørende rolle i nedbrytningen av sulfatider, som er sentrale lipidkomponenter som bidrar til korrekt funksjon av myelinskjedene rundt nervecellene. Uten funksjonell ARSA akkumulerer sulfatider i cellene, noe som fører til progressiv demyelinisering. Dette påvirker motoriske og kognitive ferdigheter, og resulterer til slutt i alvorlig nevrologisk nedbryting av nervesystemet. Selv om den genetiske bakgrunnen for MLD og etterfølgende sykdomsuttrykk er fastslått, er de molekylære mekanismer som fører til demyelinisering stort sett ukjente. Målet med dette prosjektet var å etablere et grunnlag for å undersøke patomekanismene i MLD ved å generere og karakterisere menneskelige induserte pluripotente stamceller (hiPSC) som pasientspesifikke modeller. hiPSCs ble generert ved reprogrammering av perifere mononukleære celler (PBMCs) fra donorer i en MLD-rammet familie, bestående av et sykt barn, og friske foreldre som var bærere for sykdommen. Genom-integritet, uttrykk av proliferasjon-, pluripotens- og kimlagmarkører ble vurdert blant hiPSCs for å evaluere hiPSC-kvalitet, og sammenligne egenskaper i hiPSCs mellom barn med MLD og friske kontroller. hiPSCs ble vellykket generert fra de tre individene. hiPSCs viste sammenlignbart uttrykk av pluripotensmarkører, OCT4, SSEA4, NANOG og SOX2, og proliferasjonsmarkør Ki67, noe som indikerer en stabil pluripotent tilstand. Videre vurdering av DNA-skade nivåer i hiPSCs og uttrykk av kimlagmarkører i embryoid bodies (EBs) viste varierende nivåer blant individene, noe som stiller spørsmålet om hvordan individuelle forskjeller kan påvirke hiPSC-tilstand og kvalitet. Imidlertid reduserer den begrensede prøvestørrelsen konklusjonen til disse funnene. Videre studier er nødvendige for å klarlegge de eksakte årsakene til MLD og eliminere innvirkningen av individuelle forskjeller.

Metachromatic leukodystrophy (MLD) is a devastating lysosomal storage disorder (LSD) caused by a deficiency in the enzyme arylsulfatase A (ARSA). This enzyme plays a crucial role in the degradation of sulfatides, which are central lipid components in the proper functioning of the myelin sheaths surrounding neurons. Without functional ARSA, sulfatides accumulate in the cells, thus leading to progressive demyelination. This impairs motor and cognitive skills and ultimately results in severe neurological decline. While the genetic basis of MLD and manifestation of the disease has been established, all molecular mechanisms leading to demyelination remain largely unknown. The aim of this thesis was to establish a basis for investigating the pathomechanisms of MLD by generating and characterizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as patient-specific models. hiPSCs were obtained by reprograming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from donors of an MLD-affected family consisting of a diseased child and healthy, carrier parents. Genome integrity, expression of proliferation, pluripotency and germ layer markers was assessed among the hiPSCs to evaluate hiPSC quality, and to compare characteristics between diseased- and healthy-derived hiPSCs. hiPSCs were successfully generated from the three individuals. Comparable expression of pluripotency markers, OCT4, SSEA4, NANOG and SOX2, and proliferation marker Ki67 indicated a stable pluripotent state among the hiPSCs. Subsequent assessments of DNA damage levels in hiPSCs and germ layer marker expression across embryoid bodies (EBs) revealed varying levels among the individuals. Thus raising a question of how individual differences might affect hiPSC state and quality. However, limited sample size reduces the conclusiveness of these findings. Further studies are needed to elucidate the MLD-specific causes of disease and eliminate the impact of individually-derived differences.