Effects of doxorubicin on cell death and the transcriptome in human AC16 cardiomyocytes

Abstract

Bakgrunn: Kreft og hjarte- og karsjukdom er leiande dødsårsaker i verda. Doxorubicin er mykje nytta som cellegift i kreftbehandling, men utvikling av kardiotoksisitet avgrensar bruken. Faktorar som bidreg til doxorubicin-indusert kardiotoksisitet inkluderer oksidativt stress indusert av reaktive oksygenforbindinger og hemming av topoisomerase-2β, men dei eksakte verknadsmekanismane er ikkje fullstendig klarlagt. Barn er meir sensitive for doxorubicin-indusert kardiotoksisitet enn vaksne. Kardiotoksisitet kan føre til hjartesvikt, som hjå pasientar behandla med doxorubicin har ei dødelegheit på nærare 50%. For å utvikle førebyggjande behandlingsstrategiar er det nødvendig å auke kunnskapen om prosessane involvert i doxorubicin-indusert kardiotoksisitet. Føremålet med denne oppgåva vart difor å (1) undersøke kva mekanismar som er involvert i doxorubicin-indusert celledød i AC16 kardiomyocyttar, og (2) beskrive endringar i transkriptomet til AC16 kardiomyocyttar som følgje av doxorubicin-behandling. Metoder: AC16 kardiomyocyttar vart behandla med doxorubicin (5µM) i 24 timar for å vurdere kva effektar denne cellegifta har på celledød og transkripsjon. Celledød vart konstatert ved eit laktat-dehydrogenase-assay, medan celleviabilitet og apoptose vart bedømt ved bruk av eit kombinasjonsassay. Endringar i transkriptomet vart undersøkt ved hjelp av RNA-sekvensering, bioinformatikk og genuttrykksprofilering. Resultat: AC16 kardiomyocytter eksponert for doxorubicin i 24 timar hadde signifikant auke i celledød og apoptose, og signifikant reduksjon i celleviabilitet (p < 0.0001). Totalt 17,013 gen var forskjellig uttrykt i dei to gruppene, der 9,946 var oppregulert og 7,067 var nedregulert (FDR < 0.05). 13,042 gen vart genutrykksprolifert. Dominerande signalvegar og prosessnettverk var relatert til oksidativt stress indusert av reaktive oksygenforbindinger, p53-avhengig apoptose, hypoksi, DNA-skaderesponsar og dei embryonale signalvegane Wnt/βcatenin og Hedgehog. Det var ei generell nedregulering av forskjellig uttrykte gen involvert i DNA-skaderesponsar. Dei mest relevante nettverka var assosiert med prosessar relatert til embryonal utvikling (Nettverk 1), inflammasjon (Nettverk 2) og cellevekst (Nettverk 3). Krüppel-like factor 4 framstod som ein hub i Nettverk 1. Konklusjon: 24 timar med doxorubicin-behandling førte til auka celledød og apoptose, og redusert celleviabilitet i AC16 kardiomyocyttar. Doxorubicin behandling førte til endringar i transkriptomet relatert til apoptose, oksidativt stress, inflammasjon, nedregulering av gen involvert i DNA-skaderesponsen, og reaktivering av embryonale signalvegar. Krüppel-like factor 4, Yamanaka-faktorane og Wnt/βcatenin-signalering framstår som viktige i doxorubicin-responsen. Den hittil ukjende aktiveringa av Hedgehog-signalering bør utforskast vidare i framtidige studier.

Background: Cancer and cardiovascular diseases are leading causes of death worldwide. Doxorubicin is a chemotherapeutic agent commonly used in cancer treatment; however, its use is limited by development of cardiotoxicity. Mechanisms involved in doxorubicin-induced cardiotoxicity include reactive oxygen species-induced oxidative stress and topoisomerase-2β inhibition, however the exact pathogenesis is not elucidated. Children are more susceptible to doxorubicin-induced cardiotoxicity than adults. Cardiotoxicity may cause heart failure, which in doxorubicin-treated patients have a mortality of nearly 50%. To develop preventive treatment strategies, it is necessary to increase the understanding of the processes involved in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Therefore, the aims of this thesis were to (1) investigate the mechanisms of cell death induced by doxorubicin in AC16 cardiomyocytes, and (2) characterize the transcriptional changes in doxorubicin-treated AC16 cardiomyocytes. Methods: AC16 cardiomyocytes were treated with doxorubicin (5µM) for 24 hours to assess the effect of the chemotherapeutic agent on cell death and transcription. Cell death was determined by lactate dehydrogenase assay, while cell viability and apoptosis were measured in a multiplexed assay. Transcriptional changes were explored through RNA sequencing, differential expression analysis, and gene set enrichment analysis. Results: AC16 cardiomyocytes exposed to doxorubicin for 24 hours displayed significantly increased cell death and apoptosis, and significantly decreased cell viability (p<0.0001). A total of 17,013 differentially expressed genes were identified, of which 9,946 were upregulated and 7,067 were downregulated (FDR < 0.05). 13,042 differential expressed genes (p-value cut-off < 0.01) were forwarded to enrichment analysis. Enriched pathways and process networks were related to reactive oxygen species-induced oxidative stress, p53-dependent apoptosis, hypoxia, DNA damage responses and the developmental pathways of Wnt/βcatenin and Hedgehog. Differentially expressed genes involved in the DNA damage response were generally downregulated. The most relevant networks were mainly enriched in gene ontology processes related to embryonic development (Network 1), inflammation (Network 2), and cell growth (Network 3). Krüppel-like factor 4 appeared as a central hub in Network 1. Conclusion: 24 hours of doxorubicin treatment increased cell death and apoptosis, and decreased cell viability in AC16 cardiomyocytes. Doxorubicin treatment induced transcriptional changes associated with apoptosis, oxidative stress, inflammation, downregulation of DNA damage response genes and reactivation of developmental pathways. The Krüppel-like factor 4, Yamanaka factors and Wnt/βcatenin-signalling appear as important in the doxorubicin-response. The novel observation of Hedgehog-signalling activation should be subject to further investigations.