Effekter av ketoner og hyperglykemi på mitokondriell funksjon i insulinproduserende β-celler under diabetes-lignende forhold in vitro

Abstract

Bakgrunn: Kronisk hyperglykemi, også kalt "glukotoksisitet", aktiverer ulike signalveier som har skadelige effekter på β-cellenes funksjon og overlevelse. Dette bidrar videre til utvikling av diabetes og både mikro- og makrovaskulære senkomplikasjoner. Ubehandlet diabetes kan føre til en tilstand kalt diabetisk ketoacidose, hvor det oppstår forhøyede nivåer av ketonlegemer, ofte kombinert med hyperglykemi. Nyere funn tyder på at mildt forhøyede nivåer av ketonlegemer har positive og beskyttende effekter, særlig ved ulike nevrologiske tilstander. Lite er derimot undersøkt når det gjelder effektene av hyperketonemi kombinert med hyperglykemi på mitokondriene, ved en tilstand med diabetisk ketoacidose.

Mål: Å teste for effekter av forhøyede nivåer av ketoner og glukose på mitokondriefunksjon in vitro, hovedsakelig målt som oksygenforbruk. I tillegg å undersøke effekter på mitokondrieaktivitet, insulinsekresjon under dyrkning, proteinnivå av de respiratoriske enzymkompleksene (I-V), celletall og viabilitet. Dette er parametere som gjenspeiler β-cellenes funksjon og overlevelse.

Metode: Intakte klonale β-celler fra cellelinjen INS-1 832/13 ble dyrket i komplett medium (CM). Cellene ble eksponert for CM med enten 11 mM eller 27 mM glukose, med og uten 5 mM eller 20 mM β-hydroksybutyrat (BHB), i enten 18 timer eller 48 timer. Etter endt inkuberingstid ble oksygenforbruk, mitokondrieaktivitet, insulinsekresjon under dyrkning, proteinnivå av enzymkompleksene (I-V), og celletall og viabilitet målt. Henholdsvis ved bruk av høyoppløselig respirometri (O2k OROBOROS), MTT, ELISA, Western blotting og Countess Automated Cell Counter.

Resultater: For alle de undersøkte parameterne ble det generelt funnet negative effekter på β-cellene med økt glukosekonsentrasjon og eksponeringstid. En mulig tendens til negative effekter av β-hydroksybutyrat ble observert, hovedsakelig med økt konsentrasjon og tid. Eventuelle negative tilleggseffekter av β-hydroksybutyrat ved hyperglykemi kan derfor ikke utelukkes, men var i denne studien ikke helt tydelige.

Konklusjon: β-hydroksybutyrat viste i liten grad å ha negative tilleggseffekter ved hyperglykemi, og hovedsakelig med økt konsentrasjon og eksponeringstid. Mer forskning er nødvendig for å validere disse resultatene, i tillegg til å undersøke mulige effekter på andre aktuelle parametere av mitokondriefunksjon, både in vitro og in vivo.

Background: Chronic hyperglycemia, also known as "glucotoxicity", activate different signaling pathways that have detrimental effects on β-cell function and survival. This further contributes to the development of diabetes and both micro- and macrovascular complications. Untreated diabetes can lead to diabetic ketoacidosis, a condition in which elevated levels of ketone bodies occur, often combined with hyperglycemia. Recent findings suggest that mildly elevated levels of ketone bodies have positive and protective effects, especially in various neurological conditions. However, little has been studied regarding the effects of hyperketonemia combined with hyperglycemia on mitochondria, in a condition with diabetic ketoacidosis.

Aim: Testing for effects of elevated levels of ketones and glucose on mitochondrial function in vitro, mainly measured as oxygen consumption. In addition, to investigate effects on mitochondrial activity, insulin secretion during culturing, protein levels of the respiratory enzyme complexes (I-V), cell numbers and viability. These are parameters that reflect the function and survival of the β-cells.

Methods: Intact clonal β-cells from the INS-1 832/13 cell line were grown in complete medium (CM). The cells were exposed to CM with either 11 mM or 27 mM glucose, with and without 5 mM or 20 mM β-hydroxybutyrate (BHB), for either 18 hours or 48 hours. At the end of the incubation period, oxygen consumption, mitochondrial activity, insulin secretion during culturing, protein levels of the respiratory enzyme complexes (I-V), and cell numbers and viability were measured using high-resolution respirometry (O2k OROBOROS), MTT, ELISA, Western blotting, and Countess Automated Cell Counter respectively.

Results: For all the parameters examined, negative effects were generally found on the β-cells with increased glucose concentration and exposure time. A possible tendency for adverse effects of β-hydroxybutyrate was observed, mainly with increased concentration and time. Possible adverse effects of β-hydroxybutyrate in hyperglycemia can therefore not be ruled out, but were not entirely clear in this study.

Conclusions: β-hydroxybutyrate was shown to have small negative effects during hyperglycemia and then mainly at increased concentrations and exposure times of the ketone. It would require more research to validate these results, in addition to investigate possible effects on other relevant parameters of mitochondrial function, both in vitro and in vivo.