Effects of Budesonide on the Intestinal Epithelium: Studies using IBD patient-derived Colonoids

Abstract

Bakgrunn: Tarmepitelcellene er etter hvert anerkjent som en viktig faktor i sykdomsbildet til inflammatoriske tarmsykdom (IBD). Det tradisjonelle anti-inflammatoriske steroid- legemiddelet budesonid er mye brukt i behandling av de forskjellige IBD-sykdommene, men man vet lite om effekten budesonid har på tarmepitelcellene. Problemstilling: Dette prosjektet ønsket å bruke IBD pasient-deriverte tykktarmsorganoider (kolonoider) til å se på hvordan budesonid påvirker kolonepitelet når legemiddelet brukes som en forebyggende behandling mot inflammasjonsreaksjoner fra epitelcellene indusert av TNF-a+Poly(I:C). Dette ble undersøkt ved dyrkning av kolonoidene under både atmosfærisk (20 %) og lavt (2 %) oksygennivå, og fokuset var effektene på epitelcellenes vekst, morfologi og overlevelse, samt på utskillelsen av cytokinene CXCL1 og CXCL11. Metode: Ved å bruke kolonoider, dyrket frem under både 20 % og 2 % oksygennivåbetingelser, ble budesonid tilsatt etter to forebyggende protokoller: en for langtidspåvirkning (tilsatt før differensiering) og en for korttidspåvirkning (tilsatt etter differensiering). Kolonoidene ble stimulert med TNF-a and Poly(I:C) for å fremprovosere en inflammatorisk respons. Veksten av kolonoidene ble analysert ved å ta gjentatte bilder med et EVOS-mikroskop, og mengden celledød i kolonoidene ble undersøkt med bilder av fluorescencefarging og caspase 3/7 assay. H&E farging av snitt fra parafininnstøpte kolonoidpelleter ble brukt for å undersøke morfologien til kolonoidene på slutten av eksperimentene. Vekstmediumet ble samlet inn ved avslutning av forsøk og senere analysert for cytokinene CXCL1 og CXCL11 ved hjelp av ELISA (enzyme-linked immune sorbent assay). Resultater: Kolonoidene vokste bra i både 20 % og 2 % oksygenbetingelser, men så mer motstandsdyktige ut i 2 % oksygenbetingelser. Det så ut som om budesonid hemmet veksten av kolonoidene under begge oksygenbetingelsene. Budesonid så også ut til å gi mer celledød i både ustimulerte og TNF-a+Poly(I:C)-stimulert kolonoider, med mulig unntak av når det ble tilsatt etter langtidsprotokollen, og med generelt mindre celledød i 2 % oksygenbetingelser enn i 20 % oksygenbetingelser. Effekten av budesonid på utskillelsen av cytokinene CXCL1 og CXCL11 var variable og vanskelige å konkludere for, men det var en tendens til at budesonid reduserte utskillelsen av CXCL1 fra ustimulerte kolonoider under begge oksygenbetingelsene ogat det gå en mer generell reduksjon i utskillelsen av begge cytokinene under 2 % oksygenbetingelser. Konklusjon: Effekten av budesonid på intestinalepitelet fremsto som veldig varierende og med en ubestemmelig skiftning avhengig av dose, kolonoid-donor, oksygenbetingelser og hvilken behandlingsprotokoll som ble brukt, og mer forskning må utføres for å bestemme de fulle effektene av budesonid.

Background: The intestinal epithelium has emerged as an important factor in the pathology of inflammatory bowel disease (IBD). The classical anti-inflammatory steroid drug Budesonide is commonly used in the different forms of IBD, but knowledge of its effect on the intestinal epithelium is still lacking. Aims: This project wished to use IBD patient-derived colonic organoids (colonoids) to examine how Budesonide affects the colonic epithelium when used as a pre-treatment to prevent an inflammatory reaction from the epithelium induced by TNF-a and Poly(I:C). This was examined both under atmospheric (20%) and low (2%) oxygen conditions and focus were on the effects on growth, morphology and survival of the epithelial cells, and release of the cytokines CXCL1 and CXCL11. Method: Using colonoids grown in both 20% and 2% oxygen conditions, Budesonide was added following two pre-treatment protocols, one long-term (added before differentiation) and one short-term (added after differentiation). The colonoids were stimulated with TNF-a and Poly(I:C) to gain an inflammatory response. The growth of the colonoids were analysed by taking repeated images with the EVOS microscope, and fluorescence viability imaging and Caspase 3/7 assay were used to examine the amount of cell death in the colonoids. H&E staining of paraffin-embedded colonoid pellets was used to examine the morphology of the colonoids at the end of the experiments. The growth medium was collected at the experiment conclusion and later analysed for the cytokines CXCL1 and CXCL11 using enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA). Results: The colonoids grew well in both 20% and 2% oxygen conditions but appeared more resilient when grown in 2% oxygen. Budesonide appeared to inhibit the growth of the colonoids in both oxygen conditions. Budesonide also seemed to lead to more cell death in the colonoids both unstimulated and during TNF-a+Poly(I:C) stimulation, with the possible exception of when added following the long-term protocol, and with generally less cell death in 2% oxygen conditions than 20% oxygen conditions. The effect of Budesonide on the release of cytokines CXCL1 and CXCL11 was variable and inconclusive, but there was a trend towards Budesonide lowering the release of CXCL1 from unstimulated colonoids in both oxygen conditions, and that it gave a more general lowering of both cytokines in 2% oxygen conditions. Conclusion: The effect of Budesonide on the intestinal epithelium appeared very variable and dependent on dose, colonoid-donor, oxygen growth condition and what treatment protocol used. More research is needed to increase the knowledge and determine the full effects on the epithelial cells.