Expression of Multidrug Reisistance Protein ABCB1 and Drug Sensitivity in Carfilzomib Resistant Myeloma Cell Lines

Abstract

Myelomatose/beinmargskreft er den andre mest vanlige hematologiske sykdommen i verden, og er en krefttype som kommer av ukontrollert vekst av plasmaceller i beinmargen. Det finnes foreløpig ingen kurerende behandling, ettersom pasienter utvikler resistens mot eksisterende terapi. ATP binding cassette sub family B member 1 (ABCB1) er en proteinpumpe som bruker hydrolyse av ATP til å transportere substrater mot en konsentrasjonsgradient. Aktiviteten til denne transporteren har blitt korrelert med resistens til flere typer kjemoterapi i bruk mot kreft. Man vet lite om sammenhengen mellom ABCB1 uttrykk og utvikling av resistens til proteasomehemmere, en relativt ny viktig form for kjemoterapi i bruk mot myelomatose i dag, som forårsaker celledød i myelom celler ved å inhibere nedbrytningen av proteiner i kreftcellene. Carfilzomib (CFZ) er en proteasomhemmer og et rapportert som et substrat av ABCB1 pumpen, i motsetning til bortezomib (BTZ), en annen proteasomhemmer med en mer uviss rolle som ABCB1 substrat. Oppregulert uttrykk av ABCB1 har blitt korrelert med CFZ- resistens i AMO-1-CFZ cellelinjen, og et mål med denne studien var å undersøke om ABCB1 uttrykk er en karakteristikk felles for CFZ-resistente cellelinjer, og om inhibering av ABCB1 aktivitet kan øke sensitiviteten til proteasomhemmere i celler med oppregulert uttrykk av ABCB1. Myelomgruppa ved NTNU har funnet ABCB1 RNA til ha lavt uttrykk i sorterte CD138+ myelomceller i beinmargsprøver fra CFZ-resistente pasienter med beinmargskreft, og det var også av interesse å undersøke om ABCB1 uttrykk i CFZ-resistente cellelinjer er avhengig av eksponering til CFZ. I tillegg, ble effekten av om andre medikamenter, i klinisk bruk mot myelomatose, i ABCB1-utrykkende cellelinjer undersøkt. De CFZ-resistente cellelinjene AMO-1-CFZ, JJN-3-CFZ og INA-6-CFZ, den BTZ-resistente INA-6-BTZ cellelinjen, og deres respektive proteasomehemmer-sensitive kontroll-cellelinjer var viktige verktøy i denne studien. ABCB1 uttrykk i disse cellelinjene ble undersøkt ved hjelp av western blotting. RNA uttrykk ble undersøkt med qPCR, og celleviabilitets-analyse ble brukt til å undersøke celleviabilitet i response til behandling med anti-MM medikamenter og effekten av ABCB1 inhibering i disse cellelinjene. En stabil oppregulering av ABCB1 uttrykk viste seg å være en felles karakteristikk av de CFZ-resistente cellelinjene undersøkt i denne studien, som et resultat av kultivering med CFZ over flere måneder. Små, varierende endringer i proteinuttrykk, ble funnet til å bli regulert post-transkripsjonelt i respons til CFZ eksponering i cellelinjer med moderat oppregulert uttrykk av ABCB1. INA-6-BTZ og kontroll-cellelinjene uttrykte lave nivå av ABCB1. Inhibering av ABCB1 funksjon ved bruk av ABCB1 inhibitoren cyclosporin A resulterte i delvis re-sensitivisering av INA-6-CFZ og AMO-1-CFZ cellelinjene til CFZ, og delvis til BTZ. Melphalan var like effektiv i alle cellelinjer uavhengig av om de uttrykte ABCB1 eller ikke. Pomalidomide hadde en generell lav in vitro cytotoksisk effekt. Selinexor viste seg å ha lite effekt i AMO-1-CFZ cellene med høyt uttrykk av ABCB1, mens dexamethasone hadde en overraskende god effekt i AMO-1-CFZ cellelinjen. Mer forskning er nødvendig for å undersøke om disse funnene i AMO-1-CFZ cellelinjen har en korrelasjon med det høye ABCB1 nivået i denne cellelinjen. Resultatene i denne studien indikerer at dexamethasone eller melphalan, to kjemoterapeutika allerede i klinisk bruk, kan være effektivt i myelomatose pasienter resistente til CFZ. I tillegg viser studien at aktiviteten av ABCB1 transporteren bidrar til CFZ-resistens i CFZ-resistente cellelinjer, men mer forskning er nødvendig for å redegjøre for om ABCB1 underligger CFZ-resistens i pasienter med beinmargskreft.

Multiple myeloma (MM) is the second most common hematological malignancy in the world, and is a cancer caused by uncontrolled growth of terminally differentiated plasma cells (PCs) in the bone marrow (BM). MM is considered incurable due to the development of treatment resistance in patients. The activity of the ATP binding cassette subfamily B member 1 (ABCB1), an ATPase dependent transporter capable of transporting substrates against their concentration gradient, has been correlated with resistance to a wide range of anti-cancer agents. Little is known about the correlation between ABCB1 expression and resistance to proteasome inhibitors (PI´s), a class of anti-myeloma drugs that inhibit protein degradation and induce apoptosis in MM cells. The PI Carfilzomib (CFZ) is a reported substrate of the ABCB1 transporter, but conflicting evidence exist regarding bortezomib (BTZ), another PI in clinical use against MM. Upregulated expression of ABCB1 has been reported to contribute to CFZ-resistance in the CFZ resistant AMO-1-cell line (AMO-1 CFZ), and one aim of this study was to investigate whether ABCB1 expression is a common feature of PI-resistant cell lines, and whether inhibition of ABCB1 activity can increase PI sensitivity in these cells. The myeloma group at NTNU has detected low ABCB1 RNA expression in sorted CD138+ MM cells from BM samples derived from patients refractory to CFZ, and another aim of this study was to investigate whether expression of ABCB1 in CFZ-resistant cell lines is dependent on CFZ exposure. Additionally, it was of interest to test the efficiency of other common anti-MM drugs in ABCB1-expressing cell lines. The CFZ-resistant AMO-1-CFZ, JJN-3-CFZ and INA-6-CFZ cell lines, the BTZ-resistant INA-6-BTZ cell line, and their respective control cell lines were important tools used in this master project. The ABCB1 protein expression in the cell lines were detected by western blotting upon cultivation over different periods of time with or without exposure to PI´s. RNA expression was investigated using RT-qPCR. Luminescent cell viability assays were used to test MM cell viability upon various drug conditions. A stable upregulation of ABCB1 expression was found to be a general feature abd a result of cultivation with CFZ over several months in all the CFZ-resistant cell lines investigated. Small transient changes in protein expression were found to be regulated post-transcriptionally in response to CFZ-exposure in the cell lines moderately expressing ABCB1. The INA-6-BTZ cells expressed low levelsof ABCB1, similar to the control cell line. Inhibition of ABCB1 function using the ABCB1 inhibitor cyclosporine A resulted in a partly re-sensitization of the AMO-1-CFZ and INA-6-CFZ cells to CFZ, and to a lesser extent, to BTZ. Melphalan had similar cytotoxic effect in both the CFZ-resistant and their control cells independent on their ABCB1 status. Pomalidomide had general a low in vitro cytotoxic effect, while selinexor was found to be less efficient in the highly CFZ-resistant AMO-1-CFZ cells expressing high levels of ABCB1. The AMO-1-CFZ cells were also found to be highly sensitive to treatment with dexamethasone. More research is necessary to investigate whether these results are associated with ABCB1 expression of the AMO-1-CFZ cell line. The results of this study provide a rationale for more investigation whether dexamethasone or melphalan could be effective in MM patients highly refractory to treatment with CFZ. Additionally, the results of this study indicate that the activity of the ABCB1 transporter contributes to CFZ-resistance in CFZ-resistant MM cell lines, but more research is necessary to establish whether ABCB1 underlies mechanisms of CFZ-resistance in MM patients.