Investigation into the cardiovascular effects of the 2nd generation reverse transcriptase inhibitors Rilpivirine and Dapivirine

Abstract

Humant immunsviktvirus (HIV) er et virus som angriper immunsystemet og uten behandling fører til immunsviktsykdommen, ervervet immunsviktsyndrom (AIDS). Tidligere var behandlingen for denne gruppe pasienter dårlig, men innføring av highly active antiretroviral therapy (HAART) har gitt disse pasienten en bedre framtidsutsikt med redusert mortalitet og økt livskvalitet. På tross av denne positive utviklingen med godt medikamentell behandling, har også den anti-virale behandlingen vist en rekke negativ effekter på hjerte og kar system. Den negative effekten disse legemidlene har på hjerte og kar system, samt sykdommens negative effekter i seg selv, gir disse pasientene en høyere risiko for å utvikle kardiovaskulære sykdommer som for eksempel aterosklerose.

Det er tidligere blitt vist at 1st generasjons non-nucleosid reverse transkriptase hemmeren (NNRTI), Efavirenz, har en mitokondrie tokositet i EA.hy926 celler ved å hemme compleks 1. Det er ikke funnet studier som beskriver slike egenskaper hos 2nd generasjons legemidlene Rilpivirine og Dapivirine. Det ble derfor i denne oppgaven undersøk om Rilpivirine og Dapivirine har samme toksiske egenskaper på mitokondriet som Efavirenz. Dette ble utført med hjelp av et MTT-assay for å detektere endring i celle viabillity, appoptose/necrose ble detektert ved hjelp av en fargeanalyse. Endringer i oksidative stress ble undersøk ved hjelp av DCF – assay og mitokondrie membranpotesial (MMP) ble undersøkt ved hjelp av MMP-assay. I tillegg ble det undersøk for inflammasjon ved hjelp av et ELISA assay som detekterte IL-8 og NF-kB.

Nyere studier har vist at Rilpivirine har en anti-inflammatorisk effekt ved å hemme NF-kB i både hapatocytter og makrofager. Det ble derfor i utført undersøkelser på om Rilpivirine og Dapivirine hadde tilsvarende anti-inflammatoriske egenskaper i EA.hy926 celler. Palmitic acid ble brukt som en inflammasjons-mediator i dette prosjektet. Cell viabillity ble undersøkt ved hjelp av MTT-assay og inflammasjon ble detektert ved hjelp av ELISA assay hvor det ble målt IL-8 og NF-kB. Cellen ble eksponert for både kombinasjonsbehandling (Rilpivirine/Dapivirine + palmitic acid) og Palmitic acid alene. Detektering av IL-8 ble også utført ved forsinket eksponering av Rilpivirine og Dapivirine (1,2,3,4 og 6 timer).

Både Rilpivirine og Dapivirine viste en reduksjon i cell viability ved eksponering for de høyeste konsentrasjonen. Begge legemidlene viste en økning i apoptose men bare Dapivirine viste en økning i nekrose. Begge legemidlene viste en økning i IL-8 og NF-kB, samt økt reactive oxygen specis (ROS)/oksidativ stress. Bare Dapivirine viste en endring i MMP, med en reduksjon i MMP som også tidligere er vist for 1st generasjon NNRTI, Efavirenz. Rilpivirine viste ingen endring i MMP i dette studiet.

Både Rilpivirine og Dapivirine klarte å reversere palmitic acid indusert økning i IL-8 og NF-kB ved eksponering med lave konsentrasjoner. Forsinket eksponering av Rilpivirine og Dapivirine viste anti-inflammatorisk effekt ved en forsinket eksponering opp til 3 (Dapivirine) og 6 (Rilpivirine) timer før de mistet sin anti-inflammatoriske effekt. Verken Rilpivirine eller Dapivirine viste å endre palmitic acid indusert reduksjon i cell viabillity i dette studiet.

Det konkluderes med at; 1) Rilpivirine viste en negativ effekt på endotelcellenes viabillity etter eksponering for høye konsentrasjoner, og det kan derfor ikke utelukkes at dette legemidlet kan ha negative kardiovaskulære effekter ved langtids bruk. 2) Eksponering for konsentrasjoner som i større grad var klinisk relevante for Rilpivirine, viste en anti-inflammatorisk effekt ved å hemme NF-kB aktivering. Denne anti-inflammatoriske effekten kan være en fordel for pasienter med HIV infeksjon som har en høyere risiko for å utvikle kardiovasklulær sykdom.

Human immunodeficiency virus (HIV) is a virus that attacks the immune system and without treatment leads to the immune deficiency disease, acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Previously, treatment for this group of patients was poor, but the introduction of highly active antiretroviral therapy (HAART) has given these patients a better future outlook with reduced mortality and increased quality of life. Despite this positive development, the anti-viral treatment has also shown a number of negative effects on the cardiovascular system. The adverse effects of these drugs on the cardiovascular system, as well as the adverse effects of the disease itself, give these patients a higher risk of developing cardiovascular diseases such as atherosclerosis.

Mitochondrial toxicity has previously been shown with the 1st generation non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor (NNRTI), Efavirenz, in the endothelial cell line, EA.hy926. There are no studies that describe such properties for the 2nd generation drugs Rilpivirine and Dapivirine. Therefore, in this thesis, it was investigated whether Rilpivirine and Dapivirine have the same toxic properties on the mitochondria as Efavirenz. This was performed using an MTT assay to detect change in cell viability, apoptosis / necrosis was detected using a colour analyses. Change in oxidative stress was detected by DCF assay and mitochondrial membrane potential (MMP) was detected by MMP assay. In addition, inflammation was examined using an ELISA assay that detected IL8 and NF-κB.

Recent studies have shown that Rilpivirine has an anti-inflammatory effect by inhibiting NF-κB in both hepatocytes and macrophages. Therefore, studies were performed to determine if Rilpivirine and Dapivirine had similar anti-inflammatory properties in EA.hy926. Palmitic acid was used as an inflammation mediator in this project. Cell viability was examined by MTT assay and inflammation was measured by an ELISA assay measuring IL-8 and NF-κB. The cells were exposed to both combination therapy (Rilpivirine / Dapivirine + palmitic acid) and palmitic acid alone. Measurements of IL-8 were also performed by delayed exposure to Rilpivirine and Dapivirine (1,2,3,4 and 6 hours).

Both Rilpivirine and Dapivirine showed a reduction in cell viability when exposed to higher concentrations. Both drugs showed an increase in apoptosis, but only Dapivirine showed an increase in necrosis. Both drugs showed an increase in IL-8 and NF-κB, as well as an increase in oxidative stress. Only Dapivirine showed a change in MMP.

Rilpivirine and Dapivirine were able to reverse the palmitic acid-induced increase in IL-8 and NF-κB. Delayed exposure of Rilpivirine and Dapivirine showed an anti-inflammatory effect when exposure was delayed for up to 3 (Dapivirine) and 6 hours (Rilpivirine) before losing the anti-inflammatory effect. Neither Rilpivirine or Dapivirine was able to reverse the palmitic acid-induced reduction in cell viability in this study.

In conclusion; 1) Rilpivirine showed a negative effect on endothelial cells viability after exposure to higher concentrations and it can therefore not be ruled out that this drug may have a negative effect on the cardiovascular system during long-term use. 2) Exposure to concentrations that were more clinically relevant to Rilpivirine, showed an anti-inflammatory effect by inhibiting NF-κB activation. This anti-inflammatory effect may be beneficial for patients with HIV infection who have a higher risk of developing cardiovascular diseases.