Identification of Genetic Variation in Patients Suspicious of Lynch Syndrome Using Whole Exome Sequencing

Abstract

Arvelige genetiske mutasjoner forårsaker predisposisjon til kolorektalkreft i estimerte ~30% av tilfellene av kolorektalkreft. Årsaksfaktorene til predisposisjonen er kjent i 5-10% av tilfellene, og disse er høyrisiko genetiske varianter assosiert med arvelige kreftsyndromer. Eksempelvis er mutasjoner i DNA reparasjonsgenene (MMR) årsaken til Lynch syndrom. Resterende 20% av tilfellene er definert som familiær kolorektalkreft, siden de har opphopning av kreft i familien og en tendens til utvikling av kreft i tidlig alder. Disse tilfellene har ukjente årsaksfaktorer til kreft-predisposisjonen. Det har vært flere forsøk på å identifisere årsaksfaktorene til pasienter med familiære kolorektalkreft, blant annet nestegenerasjonssekvenseringsteknikker (NGS) og genom-vide assosiasjonsstudier (GWAS) har blitt benyttet i deteksjon av mulige sykdomsfremkallende mutasjoner og kandidatgener for kolorektalkreft. Kopitallsvarianter, strukturelle endringer av genomet som involverer duplikasjoner og delesjoner, er ansvarlige for deler av predisposisjon til arvelig kreft. Formålet med masterprosjektet var å identifisere mulige sykdomsfremkallende kopitallsvarianter i eksomdata til pasienter med antatt Lynch syndrom. I tillegg var formålet å foreslå mulige kandidatgener. I forkant av dette prosjektet ble DNA isolert fra blodprøvene til 48 australske pasienter. Heleksomsekvensering ble utført, og eksomdata ble brukt i en kopitalls-analyse som detekterte kopitallsvarianter. Dette prosjektet bestod av bioinformatisk vurdering av de detekterte kopitallsvariantene, noe som inkluderte filtrering med FILTUS, manuell evaluering, tolkning med bruk av bioinformatiske ressurser og databaser, og klassifisering etter ‘ACMG/AMP guidelines’. Resultat fra assosiasjonsstudier ble benyttet til å identifisere gener assosiert med kolorektalkreft, og deteksjon av enkelnukleotidvarianter med allelfrekvens >0.05 i disse genene ble utført for pasientene. Totalt ti kopitallsvarianter ble identifisert i eksomdata til de 48 pasientene: to ‘sikker patogen’ delesjoner i EPCAM og BRCA2, én ‘sannsynlig patogen’ delesjon i RB1, og syv kopitallsvarianter klassifisert som ‘variant med usikker klinisk betydning’ (VUS). Funn fra dette prosjektet og et tilhørende prosjekt kan gi en forklaring til årsaken til den familiære kreftpredisposisjonen i fem av de 48 pasientene, og funnene kan muligens gi en forklaring til ytterligere fem pasienter. Enkelnukleotidvarianter ble detektert i de mulige kandidatgenene LAMA5, PLCL1 og POU5F1B i eksomdata til pasientene. Prosjektet har verdi i deteksjon av genetisk variasjon, spesielt kopitallsvarianter, i pasienter med antatt Lynch syndrom i jakten på sykdomsfremkallende mutasjoner.

Inheritable genetic mutations cause predisposition to colorectal cancer (CRC) in estimated ~30% of CRC cases. The causal mutations of the predisposition are known in only 5-10% of cases, and these are high-penetrant genetic variants which are associated with hereditary cancer syndromes. For example, mutations of the DNA mismatch repair genes (MMR) are causal of Lynch syndrome. The remaining 20% are familial CRC cases, with unknown causal factors for CRC predisposition, yet with familial aggregation of cancer and early age-of-onset for cancer development. There have been attempts to discover the unknown etiology of familial CRC, with utilization of next-generation sequencing (NGS) and genome-wide association studies (GWASs), by identifying novel CRC predisposing genes and causal variants. Copy number variants (CNVs), structural alterations of the genome involving deletions and duplications, are accountable for parts of hereditary cancer susceptibility. This master’s thesis project aimed at identifying possible disease-causing CNVs in the exome of patients suspicious of Lynch syndrome. Additionally, this project aimed at suggesting possible candidate genes. Prior to this project, germline DNA was isolated from the blood samples of 48 Australian patients. Whole exome sequencing was performed, and the exome data were utilized in a CNV analysis to detect copy number variation. This project consisted of bioinformatical assessment of the detected CNVs including filtering using FILTUS, manual evaluation, interpretation using bioinformatical resources and databases, and classification according to the ACMG/AMP guidelines. Results from association studies were used to find genes associated with CRC, and identification of single nucleotide variants (SNVs) in these genes were performed for the 48 patients. Ten CNVs were identified in the exome of the 48 patients: two pathogenic deletions in EPCAM and BRCA2, one likely pathogenic deletion in RB1 and seven CNVs classified as variant of uncertain significance (VUS). Findings from this project and another associated project can explain the causal factors of familial cancer predisposition in five of the 48 patients and might explain the causality in additional five patients. In addition, SNVs with minor allele frequency of >0.05 were identified in the potential candidate genes LAMA5, PLCL1 and POU5F1B in the exome of the patients. This project has value in detecting genetic variation, especially copy number variants, in patients suspicious of Lynch syndrome in the search for disease-causing mutations.