HR MAS NMR based metabolic profiling of colorectal tumor progression organoids

Abstract

Kolorektal kreft er den nest dødeligste krefttypen i Norge. Dette er delvis på grunn av et asymptomatisk sykdomsforløp som ofte forårsaker at pasienter søker medisinsk hjelp sent i sykdommen. Rask diagnose, staging og evaluering av respons til farmakologisk behandling er derfor viktig, spesielt i pasienter med metastatisk sykdom. Dagens standard er 4-6 uker for å evaluere respons på behandling som ofte er for sent. Det er derfor behov for nye diagnostiske verktøy i behandlingen av kolorektal kreft pasienter. Kreftceller utviser metabolsk reprogrammering i sin naturlige form og når de blir utsatt for cytostatika. Det er derfor trodd at metabolske responser oppstår raskere enn forandringer i tumor volum. Dette impliserer at behandlingsrespons kan evalueres etter noen dager istedenfor 4-6 uker. I denne studien bruker vi tumor progresserende organoider hvor de fire mest vanlige genetiske mutasjonene APC, KRAS, P53 og SMAD4 i kolorektal kreft har blitt sekvensielt introdusert ved bruk av CRISPR/CAS9. TPOene er behandlet med oksaliplatin (OxPt), 5-fluoruracil (5-FU), Sn-38 (aktive metabolitten av irinotecan) og kombinasjonen av disse legemidlene i 48t og 96t. Ubehandlede organoider ble skaffet på tidspunkt 0t, 48t, og 96t. Målet var å beskrive metabolsk reprogrammering under transformasjon fra normale til maligne organoider, og identifisere metabolske biomarkører for behandlingsrespons ved bruk av 1H og 31P HR MAS NMR. Resultatene indikerer at fosfokolin (Pcho), totalt kolin-inneholdende forbindelser (tCCC) og myo-inositol (myo-in) reduseres ved akkumulerte mutasjoner sammenlignet med vill-type organoider. En sterk trend av økende laktat med antall mutasjoner ble observert, men ble funnet til å ikke være signifikant. Laktat reduseres i alle behandlingene uansett mutasjoner og responsstatus. Pcho og tCCC viser behandlingsavhengighet, hvor et økende nivå er observert i organoider behandlet med 5-FU, OxPt og kombinasjonen av disse behandlingene. Pcho og tCCC skilte derimot ikke mellom responderende og ikke-responderende organoider. Responderende organoider behandlet med Sn-38 hadde reduserte mengder Pcho og tCCC uavhengig av mutasjoner, mens ikke-responderende organoider hadde uendret eller høyere nivåer av Pcho og tCCC. Disse metabolittene kan derfor potensielt brukes som biomarkører ved irinotecan behandling. Mengden alanine var redusert i organoider behandlet med Sn-38 og 5-FU, men var ikke i stand til å diskriminere mellom respons og ikke-respons i Sn-38 behandlede organoider. Mengden myo-inositol reduserte i organoider behandlet med OxPt og Sn-38 ved 48t eller 96t. Mengden myo-inositol skilte mellom responsstatus i organoider behandlet med OxPt og Sn-38 ved at ikke-responderende organoider hadde uendret eller høyere nivåer. Oppsummert ble det funnet at mengden kolin-inneholdende metabolitter og myo-inositol reduserte under malign transformasjon, mens en sterk invertert trend ble observert for laktat. Laktat vises som den potensielt beste universale biomarkøren for behandlingsrespons. Myo-inositol mengden ble observert til å redusere ved Sn-38 og OxPt behandling, og til å diskriminere mellom responderende og ikke-responderende organoider.

Colorectal cancer (CRC) is the second most deadly cancer type in Norway. This is partly due to asymptomatic disease development which often causes patients to seek medical attention in late stages of CRC. Fast diagnosis, staging and evaluation of response to pharmacological treatment is therefore important, particularly in patients with metastatic disease. By todays standard, 4-6 weeks are needed to evaluate treatment response which is often to late. There is a need for novel diagnostic tools in the management of CRC patients. Cancer cells display metabolic reprogramming in their natural form and when exposed to chemotherapeutic agents. It is therefore hypothesized that metabolic responses to treatment occurs faster than changes in tumor volume. This implies that treatment response can be evaluated after a few days instead of 4-6 weeks. In this study we utilized tumor progression organoids where the four most common genetic mutations APC, KRAS, P53 and SMAD4 in CRC have been sequentially introduced using CRISPR/CAS9. The tumor progression organoids (TPO) were treated with oxaliplatin (OxPt), 5-fluorouracil (5-FU), Sn-38 (the active metabolite of irinotecan) and a combination of these drugs, for 48 and 96hr. Untreated controls were collected at 0hr, 48hr and 96hr. The goal was to describe reprogramming during transformation from normal to malignant organoids, and to identify metabolic biomarkers for treatment response by 1H and 31P high resolution magic angle spinning. The results indicate that phosphocholine (Pcho), total choline-containing compounds (tCCC) and myo-inositol (myo-in) decreases with accumulating mutations compared to wild-type organoids. We observed a strong trend of increasing lactate with increasing mutations, but the trend was not significant. Lactate decreases with all treatments regardless of mutations and response status. Pcho and tCCC show a treatment dependency, with increasing levels when organoids are treated with OxPt, 5-FU or a combination of these drugs. However, Pcho and tCCC were unable to discriminate between responding and non-responding organoids. Organoids responding to treatment with Sn-38 showed a decrease in Pcho and tCCC levels regardless of mutations, but non-responders were observed to have a unchanged or higher amount. These metabolites could therefore potentially serve as biomarkers for response to irinotecan treatment. Alanine was observed to decrease in organoids treated with Sn-38 and 5-FU, but could not distinguish between responders from non-responders in Sn-38 treatment. Myo-inositol decreased in organoids treated with OxPt and Sn-38 at 48hr or 96hr in response to treatment. Myo-inositol discriminated between responders and non-responders where unchanged or elevated amount correlated with non-responders. In summary, it was found that the levels of choline-containing metabolites, phosphocholine and myo-inositol decreased during malignant transformation, while a strong inverse trend was observed for lactate. Lactate displayed potential as an universal biomarker for response to therapy. Myo-inositol was found to decrease in response to Sn-38 and OxPt treatment and to discriminate between responding and non-responding organoids.