Vis enkel innførsel

dc.contributor.advisorMjelle, Robin
dc.contributor.authorSognnes, Vibeke
dc.date.accessioned2020-07-24T16:01:12Z
dc.date.available2020-07-24T16:01:12Z
dc.date.issued2020
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/11250/2670189
dc.description.abstractKreft i tykktarm- og endetarm, kolorektal kreft (CRC), er den tredje hyppigste diagnostiserte og den nest mest dødelige kreftformen i verden med over 1.8 millioner nye tilfeller og 800,000 nye dødsfall i 2018. Nyere forskning tyder på at Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum), en opportunistisk, anaerob bakterie i munnhulen, har en potensiell rolle i utviklingen av CRC. Videre har nyere forskning avdekket økt uttrykk av miR-BART10-3p, et Epstein-Barr-virus miRNA, i tykktarmsvev. Målet med denne studien var å undersøke rollen til F. nucleatum og miR-BART10-3p i CRC og bestemme om og hvordan de bidrar til utviklingen av kreft. Lokalisering av F. nucleatum i koloncellelinjen DLD-1 ble undersøkt med et konfokalmikroskop. Videre ble den direkte effekten av F. nucleatum i CRC undersøkt ved å dyrke bakterien med DLD-1 og se etter endringer i cellevekst og migrasjon. For å identifisere gener som responderer på F. nucleatum ble en genekspresjonsanalyse av F. nucleatum-behandlet DLD-1 utført og validert ved hjelp av RT-qPCR og ELISA. For å identifisere humane mål-mRNA for miR-BART10-3p ble kunstig syntetisert miR-BART10-3p gitt til koloncellelinjen SW620, og den regulatoriske effekten av miRNA på målgenene ble undersøkt ved RT-qPCR og luciferase-baserte assays. Til slutt ble en in vitro-prosedyre for å etablere pasient-deriverte CRC-sfæroider utviklet for fremtidige studier av F. nucleatum og miR-BART10-3p i et fysiologisk, mikrobielt miljø som ligner in vivo-forholdene til en solid svulst. F. nucleatum ble bekreftet å ha en intracellulær lokalisering i DLD-1, men fremmet imidlertid ikke cellevekst eller migrasjon. Videre førte RNA-seq av F. nucleatum-behandlet DLD-1 til identifisering av CCL20 og CSF2, to viktige cytokiner i reguleringen av infeksjoner. Det ble observert en tidsavhengig oppregulering av CCL20- og CSF2-mRNA, i tillegg til en tids- og doseavhengig oppregulering av CCL20-protein. Ved hjelp av RNA-seq av miR-BART10-3p-behandlet SW620 identifiserte vi nedregulering av to gener, MAT2B og ELL2, som begge i tillegg kunne bekreftes som potensielle mål-mRNA for miR-BART10-3p ved bruk av in silico prediksjon. In vitro RT-qPCR validering av disse genene bekreftet at miR-BART10-3p nedregulerer MAT2B og ELL2, og luciferase-baserte assays bekreftet at MAT2B er et direkte mål-mRNA. Disse resultatene antyder at miR-BART10-3p kan fungere som en tumorsuppressor ved å nedregulere MAT2B, et gen som har vist seg å aktivere ERK/AKT-signalveiene i CRC, i tillegg til et onkomiR ved å nedregulere ELL2, et gen med tumor suppressor aktivitet i epitelcellene i prostata. Alt i alt gir den nåværende studien bedre innsikt i rollen til F. nucleatum og miR-BART10-3p i CRC, og den utarbeidede prosedyren for å lage sfæroider muliggjør ytterligere utredning av deres underliggende mekanismer i tykktarmen.
dc.description.abstractColorectal cancer (CRC) is the third most commonly diagnosed and second most deadly form of cancer worldwide with more than 1.8 million new cases and 800,000 cancer deaths in 2018. Recent studies suggest that Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum), an opportunistic anaerobe in the oral cavity, has a potential role in the development of CRC. Furthermore, recent analyses have revealed an enrichment of miR-BART10-3p, an Epstein-Barr-virus miRNA, in colorectal tissue. The present study aimed to investigate the role of F. nucleatum and miR-BART10-3p in CRC and determine if and how they contribute to tumour development. The localization of F. nucleatum in the colon cancer cell line DLD-1 was examined by confocal microscopy. Furthermore, the direct effect of F. nucleatum was evaluated by co-culturing the bacteria with DLD-1 and look for changes in proliferation and migration. To identify genes that respond to F. nucleatum, gene expression analysis of DLD-1 co-cultured with F. nucleatum was performed and validated by RT-qPCR and ELISA. To identify human targets of miR-BART10-3p, transient transfection of the miRNA mimic in the colon cancer cell line SW620 was performed, and the regulatory effect of the miRNA on target genes was investigated by RT-qPCR and Luciferase Assays. Lastly, an in vitro procedure for establishing patient-derived CRC spheroids was developed for future studies of F. nucleatum and miR-BART10-3p in a physiological microenvironment closely resembling the in vivo conditions of a solid tumour. F. nucleatum was confirmed to have an intracellular localization, but did, however, not promote cell migration or cell proliferation in DLD-1. Furthermore, RNA seq of F. nucleatum-treated DLD-1 led to the identification of CCL20 and CSF2, which are important cytokines in the regulation of inflammation. A time-dependent upregulation of CCL20 and CSF2 mRNA, as well as a dose-dependent upregulation of CCL20 protein was observed. Furthermore, RNA seq of miR-BART10-3p-treated SW620 led to the identification of the cancer-related genes MAT2B and ELL2, both of which could be confirmed as potential targets of this miRNA using in silico prediction. Using in vitro methods, the gene MAT2B was validated to be a direct target of miR-BART10-3p. These results suggest that miR-BART10-3p may function as a tumor suppressor by downregulating MAT2B, a gene that has been shown to activate the ERK/AKT pathways in CRC, as well as an oncomiR by downregulating ELL2, a gene with tumor suppressor functions in prostate epithelial cells. In conclusion, the present study provides further insight into the role of F. nucleatum and miR-BART10-3p in CRC, and the developed procedure for making CRC spheroids enables further investigation of their underlying mechanisms in a colorectal tumour.
dc.publisherNTNU
dc.titleFusobacterium nucleatum and the Epstein-Barr virus-encoded microRNA miR-BART10-3p in colorectal cancer - validating the role of the genes CSF2, CCL20, MAT2B and ELL2
dc.typeMaster thesis


Tilhørende fil(er)

Thumbnail

Denne innførselen finnes i følgende samling(er)

Vis enkel innførsel