The role of Fusobacterium nucleatum and the Epstein-Barr virus encoded EBV-miR-BART10-3p in colorectal cancer - focusing on the genes CXCL8, CSF2, SAP18 and CCND1

Abstract

Kolorektal kreft er den tredje mest vanlige krefttypen i verden, og den nest ledende årsaken til dødsfall forårsaket av kreft for begge kjønn. Utviklingen av kolorektal kreft er en prosess som foregår gjennom flere trinn som involverer både genetiske og epigenetiske endringer i tumorsuppressorgener og onkogener, som er nødvendige for initiering og progresjon av kreft. Minoriteten av kolorektal kreft-pasienter har familiær eller arvelig form av kolorektal kreft, mens majoriteten av krefttilfellene oppstår sporadisk, noe som antyder at miljø og livsstil representerer risikofaktorer for kolorektal kreft.

Økt bevissthet omkring tarmmikrobiota sin rolle i initieringen, tilrettelegging og utvikling av kolorektal kreft har i senere år vokst frem. Epstein-Barr virus og den orale bakterien Fusobacterium nucelatum er påvist oppregulert i kolorektalt tumorvev sammenlignet med tilstøtende friskt vev, noe som fremhever deres rolle i initiering og progresjon av kolorektal kreft.

Fusobacterium nucleatum er blitt vist å infisere og internalisere i den kolorektale cellelinjen DLD-1, visualisert ved LSM-konfokal mikroskopi og fluorescens-farging, samt å oppregulere cytokinene CXCL8 og CSF2 i co-kultur i cellelinjene DLD-1 og SW620. Genekspresjonen til CXCL8 og CSF2 og protein sekresjonen av CXCL8, ble vist å øke både ved inkubasjonstid og økt konsentrasjon av F. nucleatum, ved hjelp av real-time qPCR og ELISA. CXCL8 og CSF2 er begge involvert i kroppen sin immunrespons, og er vist å være involvert i initieringen og progresjonen av kolorektal kreft ved å skape et inflammatorisk mikromiljø som er gunstig for tumorprogresjonen.

Vi viser at EBV-miR-BART10-3p binder og nedregulerer genene SAP18 og CCND1 i cellelinjen SW620 ved real-time qPCR og luciferase analyse.

En pasient-derivert sfæroide metode (CTOSs), basert på CTOSs-metoden fra Kondo et al. (2011) og Jeppesen et al. (2017) er blitt utviklet og etablert, i form av sfæroidedyrking, splitting, frysing og tining. CTOSs-metoden gir et høyt utbytte av levedyktige sfæroider, som overlever prosessen med splitting, frysing og tining.

Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in the world, and the second leading cause of cancer deaths for both sexes combined. Development of CRC is a multistep process that involves both genetic and epigenetic alterations in tumor suppressor genes and oncogenes, that are required for cancer initiation and progression. The minority of CRC patients have familial (25%) or inherited (3%) form of CRC, while the majority (72%) occurs sporadically, suggesting that environmental factors are important for CRC development.

In recent years, there has been a rising awareness that the intestinal microbiota may be involved in the initiation, facilitation, and development of CRC. MicroRNAs from the infectious Epstein-Barr virus and the oral bacteria Fusobacterium nucleatum have been shown to be upregulated in CRC tissues compared to adjacent healthy tissue, indicating their role in the initiation and progression of CRC.

Here we show that Fusobacterium nucleatum internalize in the colorectal cell line DLD-1 visualized by LSM confocal microscopy and fluorescent staining, as well as upregulate the cytokines CXCL8 and CSF2 in co-culture with the cell lines DLD-1 and SW620. The gene expression of CXCL8 and CSF2, as well as the cytokine release of CXCL8, were shown to increase with both incubation time and increased concentration of F. nucleatum, as detected by real-time qPCR and ELISA assay. CXCL8 and CSF2 are both involved in the immune responses and are shown to be associated with initiation and progression of CRC by creating an inflammatory microenvironment favorable for tumor progression.

The Epstein-Barr virus originated microRNA EBV-miR-BART10-3p is shown to directly target and downregulate the genes SAP18 and CCND1 in the CRC cell line SW620, by real-time qPCR and luciferase assay.

A cancer tissue originated spheroid (CTOS) method, based on the CTOSs method from Kondo et al. (2011) and Jeppesen et al. (2017) has been developed and established, including spheroid cultivation, splitting, freezing, and thawing. The CTOSs method gives a high yield of viable spheroids, which survive the process of being split, frozen and thawed.