In vitro effects of the AMP-activated protein kinase agonist metformin on murine osteocytes MLO-Y4

Abstract

Osteoporose er en skjelettsykdom som gir økt risiko for beinbrudd. Sykdommen karakteriseres av nedsatt beinkvalitet og lav beinmasse, og er en økende bekymring grunnet en økt aldrende befolkning. Styrketrening er vist å forebygge osteoporose, i tillegg til å aktivere AMPK. Metformin er også en AMPK-aktivator, og tidligere forskning på beinceller har vist gunstige effekter på beinmetabolismen. Få studier har tidligere studert effekten av metformin hos osteocytter. Derfor ønsket vi gjennom denne studien å studere hvordan metformin påvirker viabiliteten til osteocytter, og å analysere osteocyttmarkører knyttet opp mot responsen vi ser ved trening. Gjennom disse eksperimentene ønsket vi å se om metformin kan etterligne effekten av mekanisk belastning i osteocytter in vitro. Den murine osteocytt-cellelinjen MLO-Y4 ble brukt som en modell for osteocytter, og cellene ble stimulert med 100-, 500-, og 2000 µM metformin, og sammenlignet med kontroll i alle eksperimentene. LDH aktivitets-analyse og MTT proliferasjonsanalyse ble brukt for å studere henholdsvis toksisitet og proliferasjon. qPCR ble brukt for å analysere genuttrykket av RANKL, OPG, Ptgs2, Sost, Wnt1 og Wnt3a, mens et monoklonalt ELISA kit ble brukt for å studere proteinsekresjonen av PGE2. Videre ble et ELISA kit for deteksjon av celledød brukt for å undersøke effekten metformin har på apoptose i osteocytter etter ioniserende stråling. Resultatene viser at metformin ikke øker LDH aktiviteten i MLO-Y4 celler i gitte konsentrasjoner, men ser ut til å redusere cytotoksisk skade på cellene utsatt for en dose på 100 µM. Metformin hemmer proliferasjon av MLO-Y4 osteocytter i høye doser (500 µM og 2000 µM). mRNA-uttrykket av OPG og RANKL reguleres ikke signifikant av metformin, men det ser ut til at RANKL/OPG ratioen reduseres med økende doser. Vi fant at mRNA-uttrykket av den mekanosensitive ionekanalen Piezo1 doseavhengig oppreguleres signifikant etter 24 timer med metformin. Metformin gir ingen signifikant regulering av mRNA-nivåene for Sost, Ptgs2, Wnt3a og Wnt1 etter 24, 48 og 72 timer, der alle genene er kjent for å reguleres av trening og mekanisk belastning. Proteinsekresjonen av PGE2 er kjent for å øke etter mekanisk belastning, men våre resultater viser ingen oppregulering etter stimulering med metformin. Etter en dose på 5 Gy med ioniserende stråling viser våre foreløpige resultater at metformin kan ha en dose-avhengig preventiv effekt på den økende apoptosen forårsaket av strålingen hos MLO-Y4 osteocytter, men dette må bekreftes med videre eksperimenter. For å konkludere, så ser det ikke ut til at metformin direkte etterligner effekten av trening, men at noen responser er like. I fremtidig forskning vil det være av interesse å undersøke om metformin og trening kombinert kan gi en additiv effekt på osteocytter in vitro.

Osteoporosis is a common skeletal disease associated with increased risk of fragility fractures, characterized by impaired bone quality and low bone mass, and it is a growing concern due to an aging population. Weight-bearing exercise is known to be a countermeasure against osteoporosis and it is known to activate AMP-activated protein kinase (AMPK). Likewise, metformin is an AMPK activator, and previous research on bone cells have revealed beneficial effects on bone physiology. Few studies have previously studied the effect of metformin in osteocytes. Therefore, this study aimed to investigate the effect of metformin on osteocyte survival and osteocyte markers related to the response of mechanical load, to investigate whether metformin can mimic mechanical load in osteocytes in vitro. The murine osteocyte-like cell line MLO-Y4 was used as a model for osteocytes, and the cells were stimulated with 100 µM, 500 µM and 2000 µM metformin and compared to controls in all experiments. LDH activity assay and MTT proliferation assay were used to study toxicity and proliferation, respectively. qPCR was used for examination of gene expression of RANKL, OPG, Ptgs2, Sost, Wnt1 and Wnt3a, and a monoclonal ELISA assay was used to study protein expression of PGE2. Furthermore, an ELISA cell death detection kit was used to examine the effect of metformin on apoptosis following ionizing radiation. Metformin does not increase LDH activity in MLO-Y4 osteocytes in the given concentrations, but appear to decrease cytotoxic damage to the cells exposed to a dose of 100 µM. Metformin inhibits proliferation of MLO-Y4 cells in high doses (500 and 2000 µM). mRNA expression of OPG and RANKL are not significantly regulated by metformin, but it appears that the RANKL/OPG ratio is decreased with higher doses of metformin. The mRNA expression of the mechanosensitive ion channel Piezo1 is significantly upregulated dose-dependently after 24 hours of metformin stimulation. Metformin does not significantly regulate mRNA expression of osteocyte markers Sost, Ptgs2, Wnt3a and Wnt1 after 24, 48 and 72 hours, all genes related to the mechanical load response. Protein secretion of mechanical-load inducible PGE2 is not upregulated by metformin. Following 5 Gy ionizing radiation of MLO-Y4 cells, metformin appears to prevent the apoptotic response to the radiation in a dose-dependent matter, but this needs to be confirmed with further experiments. In conclusion, metformin is not a direct mimetic of exercise and mechanical load, but some responses are similar. It will also be of future interest to investigate whether there is an additive effect of combining mechanical load and metformin stimulation in osteocytes in vitro.