Direct repair of alkylation damage in DNA and RNA by  2-oxoglutarate- and iron-dependent dioxygenases

Abstract

Direkte reparasjon av alkyleringsskader i DNA og RNA av 2-oksoglutarat- og jernavhengige dioksygenaser

All informasjon nødvendig for at en levende organisme skal utvikle seg og fungere er lagret i organismens arvestoff, DNA. Dette er et makromolekyl som kontinuerlig skades både av ytre kjemisk påvirkning, stråling og naturlige komponenter i cellene. For å sikre stabiliteten av DNA har cellene derfor egne enzymer som kan gjenkjenne og reparere DNA-skader. Av alle DNA-skadene som oppstår blir 99,99% reparert. Skader som ikke blir oppdaget og reparert kan medføre varige endringer i arvestoffet som i sin tur kan medføre arvelig sykdom, tidlig aldring og utvikling av kreft. DNA-reparasjon er derfor av fundamental betydning for alle levende organismer, og flere typer reparasjonsmekanismer er kjent. Å forstå de grunnleggende mekanismene for DNA-reparasjon har betydning innen behandling av sykdom som for eksempel kreft, og i risikovurdering i forhold til arvelige defekter i DNA-reparasjonsmaskineriet.

Studiene som presenteres her omhandler en reparasjonsmekanisme der enkle alkyleringsskader som 1-metyladenin og 3-metylcytosin i DNA blir fjernet direkte i en étt-trinns enzymatisk prosess. Enzymene som utfører denne reparasjonen er dioksygenaser som finnes i én eller flere varianter i alle undersøkte organismer. Mens bakterier har kun én variant, AlkB, har mennesker minst 8 varianter eller AlkBhomologer. Den bakterielle AlkB og AlkB-homolog 1, 2 og 3 (ABH1, ABH2 og ABH3) i mus og menneske har vært hovedfokuset i dette arbeidet.

Vi har studert den molekylære katalysemekanismen til human ABH3 (hABH3) ved å løse dets tredimensjonale struktur og analysere effekten av sete-spesifikke mutasjoner. Aminosyrer som er viktige for katalysen ble identifisert, i tillegg til en struktur som sannsynligvis fungerer som et lokk som vipper den skadde basen inn i det aktive setet.

For å undersøke de biologiske rollene til ABH2 og ABH3 gjorde vi målinger på mus som mangler disse enzymene. Ved hjelp av verktøy som massespektrometri fant vi at mus og musecellekulturer som mangler ABH2 også mangler evnen til å fjerne 1-methyladenin og 3-metylcytosin fra sitt DNA. Tilsvarende mus og musecellekulturer som mangler ABH3 reparerer derimot disse skadene som normalt. Dette viser at ABH2 er hovedenzymet for reparasjon av 1-methyladenin og 3- metylcytosin i DNA, mens ABH3 sannsynligvis har en annen, ukjent biologisk funksjon. For å finne ut om reparasjon av det beslektede makromolekylet RNA kan være biologisk signifikant kartla vi så skadeomfanget i RNA i museceller, og fant at RNA skades ~25 ganger hyppigere enn DNA. Videre undersøkte vi om RNAreparasjon foregår i bakterier, og fant at AlkB reparerer hovedsakelig 3-metylcytosin i små, stabile RNA kalt tRNA, mens det har liten virkning på andre typer RNA. Dette kan tyde på at reparasjon av visse typer RNA er biologisk signifikant.

Vi karakteriserte human ABH1 (hABH1) med hensyn på vevsuttrykk, subcellulær lokalisering og enzymatisk aktivitet. hABH1 er uttrykt i alle undersøkte vev, mest i skjelettmuskulatur og hjerte. I celler er hABH1 lokalisert både i kjerne og mitokondrier. Aktivitetsstudier viste at hABH1 er en funksjonell AlkB-homolog som kan reparere 3-metylcytosin i enkelttrådet DNA og RNA.