Genetic Interaction Between DNA Repair Factors in Lymphocyte Development

Abstract

Dobbeltråd-brudd (DSB) på DNA-tråden er den mest cytotoksiske skaden i cellene våre. I løpet av utviklingen av B- og T-celler introduseres DSBs med vilje i løpet av V(D)J rekombinasjonen, og repareres av den ikke-homologe sammenføyningsmekanismen (nonhomologous end-joining, NHEJ). NHEJ tar i bruk kjernefaktorer (Ku70/Ku80, XRCC4 og LIG4) og tilleggsfaktorer (f.eks. XLF, PAXX og MRI). DSBs aktiverer mange DNA-skaderespons (DDR) faktorer, inkludert acetyltransferasene Gcn5 og PCAF som er involvert i mange cellulære prosesser via acetyleringen av histon H3 på lysin 9 (H3K9). Rollen til NHEJ og DDR-faktorer er ennå ikke fullt forstått, og mange av faktorene har overlappende funksjoner. Ved å bruke CRISPR/Cas9-metoden ble Gcn5-/-, Pcaf-/- og Gcn5-/-Pcaf-/- umodne v-Abl pro-B celler generert for å undersøke rollen til Gcn5 og PCAF i V(D)J-rekombinasjon. Fraværet av både Gcn5 og PCAF hemmet ikke V(D)J-rekombinasjon og førte ikke til endring av det globale nivået av histon H3K9-acetylering, noe som tyder på at Gcn5 og PCAF er erstattbare i løpet av de tidlige stadiene av B-lymfocyttutvikling.

Mri-/- mus har ingen spesifikk fenotype i vekst eller utvikling av immunsystemet, og har en normal størrelse og vekt på thymus, milt og kroppen. Det er heller ingen signifikant forskjell i antallet splenocytter og thymocytter sammenlignet med heterozygote kontrollmus. I tillegg var det ingen forskjell i B- og T-cellefrekvensen i milten, eller CD4+ og CD8+ T-celleproporsjoner i milten og thymus i mus som manglet MRI. Disse resultatene indikerer at MRI ikke er påkrevd for vekst og utvikling av immunsystemet, og at mangel på MRI kan kompenseres av andre NHEJ-faktorer i lymfocyttutvikling i mus.

Delvis eller full inaktivering av Trp53 redder Xlf-/-Paxx-/- mus fra embryonal død. Vekst og immunsystemutvikling ble analysert hos Xlf-/-Paxx-/-Trp53+(-)/- mus. Vekten av milten, thymus og kroppen, i tillegg til antallet av splenocytter og thymocytter, var signifikant lavere i Xlf-/-Paxx-/-Trp53+(-)/- mus sammenlignet med Xlf-/- og Paxx-/- enkel-knockout mus og heterozygote kontrollmus. I tillegg, hadde Xlf-/-Paxx-/-Trp53+(-)/- mus nesten ingen B celler i milten, og en lav andel T celler. Både CD4+ og CD8+ T celler ble observert i milt og thymus, i tillegg til en nesten normal andel CD4+CD8+ T celler i thymus, men ved et mye lavere antall enn i Xlf-/- og Paxx-/- enkel-knockout mus og heterozygote kontrollmus. Disse resultatene indikerer overlappende funksjoner mellom XLF og PAXX i B- og T-celleutvikling hos mus.

DNA double-strand breaks (DSBs) are the most cytotoxic lesions in our cells. During B and T lymphocyte development, DSBs are introduced on purpose during V(D)J recombination and are repaired by the non-homologous end-joining (NHEJ) pathway. NHEJ utilizes core factors (Ku70/Ku80, XRCC4 and LIG4) and accessory factors (e.g. XLF, PAXX or MRI). DSBs activate many DNA damage response (DDR) factors, including the acetyltransferases Gcn5 and PCAF involved in many cellular processes through the acetylation of histone H3 on lysine 9 (H3K9ac). However, the role of NHEJ and DDR factors during lymphocyte development is not fully understood, and many of the factors have overlapping functions. Using the CRISPR/Cas9 technology, Gcn5-/-, Pcaf-/- and Gcn5-/-Pcaf-/- immature v-Abl pro-B cells were generated to elucidate the role of Gcn5 and PCAF during the V(D)J recombination. The absence of both Gcn5 and PCAF did not impair V(D)J recombination, or change the global level of histone H3K9 acetylation, suggesting that Gcn5 and PCAF are dispensable during the early stages of B lymphocyte development.

Mri-/- mice had no overt phenotype in growth or immune system development, with a normal size of thymus, spleen, and body. In addition, there were no significant differences in numbers of splenocytes and thymocytes compared to heterozygous controls. Furthermore, there were no differences in B and T cell frequencies in the spleen, or CD4+ and CD8+ T cell proportions in the spleen and thymus in MRI-deficient mice. These results suggest that MRI is not required for growth and immune system development, and that lack of MRI can be compensated by other NHEJ factors in lymphocyte development in mice.

Partial or full inactivation of Trp53 rescue Xlf-/-Paxx-/- mice from embryonic lethality. Growth and immune system development were analyzed for Xlf-/-Paxx-/-Trp53+(-)/- mice. The weight of the spleen, thymus, and body, as well as the number of splenocytes and thymocytes, were significantly lower in Xlf-/-Paxx-/-Trp53+(-)/- mice compared to Xlf-/- and Paxx-/- single knockout mice or heterozygous control mice. In addition, Xlf-/-Paxx-/-Trp53+(-)/- mice had almost no B cells in the spleen and a low T cell proportion. Both CD4+ and CD8+ T cells were observed in the spleen and thymus, in addition to an almost normal CD4+CD8+ T cell frequency in the thymus, although at much lower numbers than in the Xlf-/- and Paxx-/- single knockout mice or heterozygous control mice. These results suggest overlapping functions between XLF and PAXX in B and T lymphocyte development.