Testing the flexibility of mitochondrial functioning in insulin-producing β-cells under diabetes like conditions in vitro
Abstract
Bakgrunn: Kronisk hyperglykemi er skadelig for de insulinproduserende β-cellene i pankreas. Mitokondrienes funksjon i disse cellene er helt essensiell for at β-cellene skal fungere optimalt. Mitokondriene påvirkes trolig også av hyperglykemi, men i hvilken grad og på hvilken måte er ikke fullstendig kartlagt.
Mål: I denne masteroppgaven har hovedmålet vært å se på effekter av høye glukoseverdier (en in vitro etterligning av hyperglykemi) på mitokondriell respirasjon (et mål på mitokondriefunksjon) i klonale β-celler. Ved å se nærmere på dette, håper jeg å finne ny forståelse og nye perspektiver når det kommer til eksperimentell diabetesforskning.
Metoder: Jeg begynte med å måle mitokondriell respirasjon i intakte klonale β-celler (INS-1 832/13) etter først å ha utsatt cellene for et høyt glukosenivå i 24 timer. Deretter gjentok jeg samme type eksperimenter, men økte eksponeringstiden fra 24 timer til 72 timer. Den neste protokollen jeg fulgte gikk ut på å teste for effekt på β-cellene av fettsyren palmitat sammen med høye glukosenivåer. Det jeg målte i alle disse forsøkene, var hvor mye oksygen cellene forbrukte (pmol/sekund/million celler) i ulike stadier av den mitokondrielle respirasjonen. Dette ble gjort ved hjelp av et apparat fra OROBOROS.
Jeg utførte samme type målinger også på permeabiliserte INS-1 celler, men her med fokus på respirasjon ved induksjon av elektronstrøm gjennom enzymkompleks II. I samarbeid med et laboratorium ved Karolinska Institutet i Stockholm (Sverige), ble det i tillegg utført immun-blotting av proteiner fra de mitokondrielle enzymkompleksene I-V.
Resultater: I de intakte β-cellene (INS-1 832/13) som ble eksponert for høy glukosekonsentrasjon i 24 timer, var det en økt respirasjonshastighet i alle stadier av respirasjonen (p<0.05 for forskjell vs. kontrollceller). I tillegg var graden av ukoblet respirasjon økt hos cellene som hadde vært utsatt for høy glukosekonsentrasjon når man sammenlignet med kontrollcellene. Når jeg økte eksponeringstiden for høy glukosekonsentrasjon til 72 timer, forsvant økningen i respirasjonshastighet i de ulike respirasjonsstadiene som jeg observerte i 24-timerseksperimentene.
I protokollen med permeabiliserte celler, fant jeg ingen signifikante forskjeller i respirasjonshastighet mellom β-celler eksponert for høy glukose i 24 timer sammenlignet med kontroll. Imidlertid fant jeg via Western-blottene fra intakte celler at proteinnivået fra kompleks II hadde økt signifikant mer enn proteinnivået fra kompleks I etter eksponering for høye glukose i 24 timer.
Et sidefunn i denne studien var en redusert inhiberende effekt på respirasjonen ved tilsats av kompleks I-inhibitoren, rotenon, etter at β-cellene hadde vært eksponert for høy glukosekonsentrasjon. Tilsats av mer rotenon endret ikke på dette, noe som utelukker at den reduserte rotenon-effekten skyldtes svekket sensitivitet (for rotenon) hos kompleks I.
Konklusjon: Resultatene fra arbeidet med denne masteroppgaven viser at mitokondriene i β-cellene evner å tilpasse seg en situasjon med overskudd av næring (glukose). Et økt forbruk av oksygen etter 24 timers eksponering for høye glukose, men ikke etter 72 timer, er i samsvar med andre med funn fra native β-celler, det vil si økt insulinsekreteringsfunksjon etter akutt eksponering for høye glukosekonsentrasjoner, men nedsatt funksjon etter forlenget eksponering. Mer forskning trengs for å se nærmere på detaljer i molekylære mekanismer bak mine funn. Background: Chronic hyperglycemia in diabetes is damaging to insulin producing pancreatic β-cells. Mitochondrial function is essential for β-cell function and may be affected by hyperglycemia, however details are insufficiently characterized.
Aim: This thesis aimed to look at the effects of exposure over time to elevated glucose levels (an in vitro substitute for hyperglycemia) on mitochondrial respiration in clonal β-cells, hoping to give some new insight and perspective in the field of experimental diabetes research.
Methods: The study was initiated with measuring mitochondrial respiration in intact clonal β-cells (INS-1 832/13) after 24h exposure to elevated glucose levels. I continued with the same type of experiments prolonging the exposure time to 72h. A further protocol tested for a combined effect of elevated glucose levels and the fatty acid, palmitate, in the culture media. The parameters measured were respiratory states (O2-flux; pmol/second/million cells) as obtained from using an OROBOROS instrument.
Respirometry on permeabilized INS-1 cells was also performed, using substrates to induce electron flow through complex II. Also immunoblotting of proteins of mitochondrial complexes were performed in a collaboration with a laboratory at the Karolinska Institute in Stockholm. Results: An over-all increased respiration in intact clonal β-cells (INS-1 832/13) exposed to elevated glucose levels for 24h was found (p<0.05). In addition, the degree of uncoupled respiration was increased in the β-cells exposed to elevated glucose levels for 24h compared to control. When prolonging the exposure time of elevated glucose levels to 72h, the over-all increased respiration seen in the 24h-experiments vanished. Using a protocol for permeabilized cells, a closer look at respiration through complex II was possible. Using this protocol, no significant differences were found when comparing respiration in β-cells exposed to elevated glucose levels to control cells. However, Western blots from non-permeabilized cells showed that protein levels of complex II were significantly increased vs. protein levels of complex I after 24h exposure to elevated glucose levels.
A side finding was a reduced inhibitory effect of the complex I inhibitor rotenone after exposure to elevated glucose levels. Increasing concentrations of rotenone failed to alter the reduced effects of rotenone, hence failing to support the notion of decreased sensitivity to rotenone.
Conclusions: The results highlight mitochondrial flexibility of β-cells when challenged with a situation of nutrient excess. Increased oxygen consumption after 24h but not after 72h of exposure to elevate glucose levels seems to be in qualitative agreement with other parameters of β-cell function in native β-cells, i.e. increased function after acute exposure, but decreased after prolonged exposure to elevated glucose. Further studies are needed to explore in detail the molecular mechanisms behind my findings.