| dc.description.abstract | Sammendrag
Bakgrunn
Ekstracellulære vesikler (EV) er sirkulerende, celleavledede nanopartikler som inndeles i eksosomer, mikrovesikler (MV) og apoptotiske legemer basert på størrelse og biogeneseveier. EV inneholder proteiner, lipider og nukleinsyrer som reflekterer opphavscellens fysiologiske tilstand, og som kan interagere med og modifisere lokale og fjerntliggende cellulære mål. Formålet med dette prosjektet var å isolere og karakterisere EV fra humane skjelettmuskelceller (myotuber) fra pasienter med sykelig overvekt med tanke på konsentrasjon, størrelse, overflatemarkører og innhold. Videre var det ønskelig å detektere mulige forskjeller mellom EV fra myotuber isolert fra type 2-diabetiske (T2DM) og normale glukosetolerante (NGT) muskelbiopsi-donorer for å identifisere potensielle, sirkulerende EV-baserte biomarkører.
Metoder
Primære humane skjelettmuskelceller fra sykelig overvektige donorer diagnostisert med og uten T2DM ble dyrket in vitro og differensiert til myotuber ble brukt i dette prosjektet. Muskelbiopsier ble tatt under bariatrisk kirurgi etter informert samtykke fra pasientene. EV ble isolert fra serumfrie cellekulturmedier fra myotuber, og eksosomer og MV ble separert ved å benytte en kombinasjon av sentrifugerings- og ultrafiltreringsteknikker. Nanoparticle tracking analysis (NTA) ble brukt til å måle konsentrasjon og størrelse av EV. Overflatemarkørene som CD63 og CD81 ble detektert ved hjelp av CD81-merkede magnetiske kuler og flowcytometri. Transmisjons-elektronmikroskopi (TEM) ble benyttet for å undersøke morfologi/struktur til EV, og protein- og mikroRNA (miRNA)-innhold ble studert ved å utføre henholdsvis proteomikk og revers-transkriptase-kvantitativ sanntids polymerase-kjedereaksjon (RT- sanntids qPCR) analyse.
Resultater
NTA-måling av eksosomer og MV viste at partikkelstørrelse hovedsakelig var innenfor de forventede størrelsesområder for disse subtypene av EV. Konsentrasjonen av EV ble observert å ligge veldig jevnt i begge gruppene, og det ble ikke vist signifikant forskjell i verken størrelse eller konsentrasjon av EV. Flowcytometrianalysen bekreftet tilstedeværelse av overflatemarkørene CD81 og CD63 på en CD81-positiv subpopulasjon av EV, men det var ingen signifikant forskjell mellom gruppene. Med proteomikkanalyse ble det identifisert totalt 690 proteiner i isolerte eksosomer fra begge donorgruppene, hvorav 604 proteiner var tilstede i begge donorgruppene. Av disse 604 proteinene var 204 proteiner tilstede i signifikante ulike nivåer i de to donorgruppene. I T2DM-gruppen var det 184 proteiner som hadde høyere nivåer og 21 proteiner som hadde lavere nivåer i forhold til NGT-gruppen. Ingenuity pathway analysis (IPA) av overlappende EV-proteiner viste tilstedeværelse av muskelspesifikke proteiner i T2DM-gruppen, samt proteiner relatert til ulike prosesser som energihomeostase og sykdomsutvikling. Videre ble proteiner involvert i metabolske prosesser som glykolyse og glukoneogenese, samt proteiner involvert i utvikling og funksjon av kardiovaskulært system og kardiotoksisitet funnet å være signifikant påvirket i T2DM-gruppen. I eksosomer isolert fra myotuber fra T2DM-gruppen ble det observert et klart økt nivå av muskelspesifikke miRNA, miR-1-3p, miR-133a, og miR-206 i forhold til eksosomer fra NGT-gruppen.
Konklusjon
Humane skjelettmuskelceller fra ekstremt overvektige donorer diagnostisert med T2DM og NGT dyrket in vitro skiller ut både eksosomer og MV som inneholder overflatemarkørene CD81 og CD63. Det ble ikke observert signifikante forskjeller i verken konsentrasjon, størrelse eller i tilstedeværelse av overflatemarkørene CD81 og CD63 mellom gruppene. Derimot ble det observert store forskjeller i både proteininnhold og nivået av noen utvalgte muskelspesifikke miRNA i eksosomer isolert fra T2DM-gruppen sammenlignet med NGT-gruppen. Resultater fra denne studien gir en indikasjon på at innholdet i EV fra myotuber er spesifikt og relatert til status av opphavscellen, og blir påvirket av T2DM som vist i denne studien. Det trengs flere repeterende og utdypende studier av disse forsøkene som kan bidra til å gi innsikt i EV og deres fysiologiske betydning. | |
| dc.description.abstract | Abstract
Background
Extracellular vesicles (EV) are circulating, cell-derived nanoparticles that are divided into exosomes, microvesicles (MV) and apoptotic bodies based on size and biogenesis pathways. EV contain proteins, lipids and nucleic acids that reflect the physiological state of their parent cell and which can interact with and modify local and distant cellular targets. The purpose of this project was to isolate and characterize EV from human skeletal muscle cells (myotubes) from morbidly obese patients by their concentration, size, surface markers and cargo components. Further, we wanted to study possible differences between EV from type 2-diabetes mellitus (T2DM) and normal glucose tolerant (NGT) muscle biopsies donors in order to identify potential circulating EV-based biomarkers.
Methods
Primary human skeletal muscle cells from morbidly obese donors diagnosed with and without T2DM cultured in vitro and differentiated into myotubes were used in this project. Muscle biopsies were taken during bariatric surgery after informed consent from the patients. EV were derived from the serum-free cell culture medium of myotubes, and exosomes and MV were separated using a combination of centrifugation and filtration techniques. Nanoparticle tracking analysis (NTA) was used to measure the concentration and size of exosomes and MV. The surface markers CD63 and CD81 were detected using CD81-labelled magnetic beads and flow cytometry. Transmission electron microscopy (TEM) was used to investigate morphology/structure of EV, and large-scale analysis of protein and microRNA (miRNA) content was performed by proteomics and real-time reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), respectively.
Results
The NTA measurements of exosomes and MV showed that particle size was predominantly within the expected size ranges of the EV subtypes exosomes and MV, respectively. The concentration of EV was observed to be almost evenly identical in both groups, and no significant differences in either concentration or size was shown between groups. The flow cytometry assay confirmed the presence of CD81 and CD63 surface markers on a CD81-positive subpopulation of EV, and there was no difference between the presence of EV surface markers between the two group of cells. With the proteomic analysis, a total of 690 proteins were identified in isolated exosomes from both donor groups, of which 604 proteins were present in both groups. Among these 604 proteins, there were 204 proteins present in significantly different levels between the groups. In the T2DM-group, 184 proteins had higher levels and 21 proteins had lower levels as compared to the NGT-group. Ingenuity pathway analysis (IPA) of overlapping 204 proteins, which were present in significantly different levels between the groups, showed the presence of muscle-specific proteins as well as proteins related to various biological processes such as energy homeostasis and disease development in T2DM-group. Furthermore, proteins involved in metabolic pathways such as glycolysis and gluconeogenesis, as well as proteins involved in development and function of cardiovascular system and cardiotoxicity were significantly affected in T2DM-group. In the exosomes of the T2DM-group, a clearly increased level of the muscle-specific miRNA, miR-1-3p, miR-133a and miR-206 was observed as compared to the NGT-group.
Conclusion
Human skeletal muscle cells taken from morbidly obese donors diagnosed with T2DM and NGT cultured in vitro secreted both exosomes and MV containing the CD81 and CD63 surface markers. However, no significant differences in either concentration, size or presence of surface markers were observed between the groups. In contrast, large differences in protein content and the level of some selected muscle-specific miRNA such as miR-1-3p, miR-133a and miR-206, were observed in exosomes isolated from the T2DM-group compared to the NGT-group. Results from this study indicate that the content of EV from myotubes is very specific, related to the status of the parent cell and is affected by T2DM, as shown in this study. Several in-depth studies of these differences are needed to provide insight into EV and their physiological significance. | |