| dc.description.abstract | Opioide peptider forekommer både som eksogene- og som endogene peptider. Endogene peptider er kroppens egne peptider som blant annet funger som eget kontrollsystem på smerter, mens eksogene peptider hovedsakelig kommer utenfra i form av matvarer som f.eks. melk/meieriprodukter og hvete. Eksogene peptider har vist seg å kunne kompleksere seg til target makromolekylær slik som endogene peptider gjør.
Hensikten med denne oppgaven var å utvikle en analytisk metode basert på LC-MS for utvalgte eksogene og endogene opioide peptider i plasma og fullblod. Peptidblanding bestående av 11 peptider ble analysert, hvor noen bestemte peptider ble videre analysert basert på deres fysikalsk og kjemiske egenskaper og deres opphav. Eksogene peptider som kasomorfiner (beta-kasomorfin-3, beta-kasomorfin-4 amid og beta-kasomorfin-7), gluteneksorfiner (gliadorfin-7 og gluteneksorfin-C) og en endogen peptid (met-enkefalin-arg-phe) ble dermed valgt for å studere videre.
Målet i denne oppgaven var delt i 2 deler:
1. Utvikle og optimalisere en eksisterende LC-MS metoden slik at vi kunne detektere lavest mulig konsentrasjon av peptider. Lave deteksjongrenser er en forutsetning for å kunne studere peptider i "dried blood spots" (DBS).
2. Avsette blod med tilsatt peptidblanding som DBS på kommersielle prøvekort (Whatman 903TM Specimen Collection Paper) og se om vi kunne ekstrahere peptider og detektere dem ved bruk av LC-MS. Videre skulle det studeres i hvilken grad peptidene stabiliseres ved adsorpsjon på prøvekortet, og om det eventuelt var behov for tilsetting av peptidasehemmere som sitronsyre. Tidligere metoder for ekstraksjon av peptider som standardproteinfelling og proteinfelling ved brønnplater ble bruk som refferanser for å sammenlikne ekstaksjonsuttbytte og ekstrajsonsprofil i forhold til dry blood spot metode.
Under metodeutvikling ble det utviklet og optimalisert metoder for både prøveopparbeidelse, HPLC og «Time-of Flight»-massespektrometri.
Under HPLC metodeutviklingen ble 2 typer seperasjonskolonner testet ut for å se hvilke kolonner som ga best seperasjon og deteksjon av analyttene. C8-kolonnen viste seg å gi best seperasjon og deteksjon av analyttene. Mobilfase som ble kjørt i kolonnene var ultra rent vann og acetonitril der begge var tilsatt 0,1% maursyre, hvor gradienteluering ble benyttet.
Under MS-metodeutvikling ble 4 parametere ved elektrosprayionisasjon testet for optimalisering: Kappegasstemperatur ("Sheat gas"), kappegasshastighet, nebulizer trykk og kapillærespenning. Målet var å overføre så mye av analyttene over til ionisert form for å få best deteksjon ved MS. En kombinasjon av høy kappegasstemperatur, høy kappegass hastighet, lav nebulizer trykk og høy kapillærespenning ga best deteksjon av peptider.
Analyseinstrumentets deteksjonsgrense ble beregnet for rene standarder hvor det ble injisert 125 ng/ml av peptidblanding med 11 peptider. Både statistiske beregninger og signal-støy-forhold målinger ble brukt som deteksjonskriterier for å estimere deteksjonsgrensen (LOD) til 5 utvalgte peptider. Ved å bruke statistiske bergeginger basert på ensidig-t-test for resultatene fra 10 repikatinjeksjoner, ble instrumentets deteksjonsgrene (IDL) estimert. Deteksjonsgrensen for CM-3 ble 4,3 ng/ml, BCM-4 6,3 ng/ml, BCM-7 6,1 ng/ml, GLU-C 3,5 ng/ml og GLIA-7 2,2 ng/ml. Det ble derette laget rene standarder for hvert enkelt peptid i IDL konsentrasjonene som ble beregnet for å verifisere de beregnede deteksjonsgrensene. Alle 5 peptider ble detekter ved instrumentetsdeteksjonsgrense-konsentrasjonene. Nye IDL ble til sammenlikning beregnet ved å bruke signal-støy-forhold (SNR) som deteksjonskriterie. Dette viste seg at vi fikk enda lavere LOD når vi bruke SNR som deteksjonskriterie. Deteksjonsgrensen for BCM-3 ble dermed 89,6 pg/ml, BCM-4 254,4 pg/ml, BCM-7 150,9 pg/ml, GLU-C 214,3 pg/ml og GLIA-7 206,3 pg/ml.
I denne oppgaven ble det utprøvd tre typer prøveopparbeidelsesmetoder: To av prøveopparbeidelses-metodene var basert på proteinfelling ved tilsetting av denatureringsreagenser til blodprøvene - enten i reagensrør eller ved bruk av RPPT-brønnplater. Til disse forsøkene er det benyttet peptidblandinger i plasma. Det viste seg at proteinfelling i RPPT-brønnplater ved å bruke fellingsreagens ACN med 0,1% maursyre ga best gjenfinngsgrad. En peptidblanding som opprinnelig inneholdt 50 ng/ml før ekstraksjon viste å gi gjenfingsgrad på over 70% for de fleste peptider.
Den tredje metoden var basert på DBS noe som var nytt i denne oppgaven. Her ble peptidblanding løst i henholdsvis vann med 0,1 % maursyre (rene standarder), plasma og fullblod. Deretter ble prøvematerialet spottet på DBS og ekstrahert med MeOH med 0,1% maursyre.
Analyse av ekstrakter fra DBS ble gjort ved å sammenligne rene standarder med peptidblanding i plasma og fullblod hvor begge var tilsatt sitronsyre som peptidasehemmer. Det ble også testet peptidblanding i fullblod uten sitronsyre. Det viste seg at peptidblanding i plasma og fullblod med og uten sitronsyre hadde gjennifinngsgrad over 100% for de fleste peptider. Det ble også observert at gjennfingsgraden var høyere for peptidblanding i plasma enn for fullblod. Det ble også sett at sitronsyren ikke hadde stor betydning som peptidasehemmer ved bruk av DBS. Det var variasjoner mellom de samme DBS prøvene som kom av spotte-teknikk og puncheteknikk. Et grovt estimat av metodens dekteksjonsgrense (MDL) ble beregnet for peptidblandinger i fullblod med og uten sitronsyre ved hjelp av SNR. Det ble grovt estimert at MDL for peptider i fullblod med sitronsyre for BCM-3 ble 3,32 ng/ml, BCM-4A 4,66 ng/ml, BCM-7 10,32 ng/ml, Met-enkefalin-arg-phe 28,57 ng/ml og for GLIA-7 42,51 ng/ml. For peptidblanding i fullblod uten sitronsyre ble verdiene for BCM-3 3,42 ng/ml, BCM-4A 4,84 ng/ml, BCM-7 9,89 ng/ml, Met-enkefalin-arg-phe 32,69 ng/ml og GLIA-7 44,15 ng/ml. Realtivutbytte ble beregnet for peptid i plasma for RPPT-brønnplate sammenliknet med DBS. Amid analogene BCM-4A og BCM-5A viste å gi en større realtivutbytte i DBS.
For å kunne si om metoden er egnet til klinisk bruk er det viktig å ta hensyn til hva som er normale og patologiske verdier hos mennesker. I vitenskaplige studier ble det funnet verdier for patologiske konsentrasjoner i plasma for BCM-5 ca. 15000 ng/ml og BCM-7 ca. 4,7 ng/ml. Patologiske konsentrasjoner i urin er også blitt sett for BCM-7 hvor konsentrasjonen er ca. 75 pg/ml. Det ble ikke funnet noe litteratur på patologiske nivåer av de andre peptidene i denne oppgaven. Resultatinnhenting fra ulike databaser for å finne mer informasjon om plasmakonsentrasjoner av flere av disse peptidene er derfor av stor betydning for å kunne vurdere metodens egnethet ved klinisk bruk. | |
