Utvikling av real-time PCR assay for påvisning av Staphylococcus epidermidis

Abstract

Bakgrunn: Staphylococcus epidermidis er ledende årsak til infeksjon i implanterte fremmedlegemer på grunn av bakteriens evne til å kolonisere og danne biofilm på kunstige overflater. Rask identifikasjon av agens ved fremmedlegemeinfeksjoner er viktig for optimal behandling, men ved St. Olavs hospital i dag fins det ikke en hurtigere metode enn dyrkning for diagnostikk av stafylokokkinfeksjon. PCR er derfor ønsket som diagnostisk metode. Oppgavens målsetning er å etablere en sensitiv og spesifikk real-time PCR for påvisning av S. epidermidis og fastslå om metoden kan benyttes i rutineundersøkelse av kliniske prøver. På noe lengre sikt er det en forventning om at resultatet kan bli ledd i utviklingen av et PCR-panel for diagnostikk av fremmedlegemeinfeksjoner. Materiale og metode: I oppgaven ble det sett på fem konserverte gener (hsp60, gap, sodA, rpoB og tuf) hos stafylokokker og designet et primerassay til hver av genene. Alle primersett ble analysert in silico og er testet med real-time PCR med EvaGreen-deteksjon mot et panel på sju stafylokkspecies. Primerpar hsp60 og TaqMan-probe er i tillegg testet mot 12 kliniske prøver hvor stafylokokker var påvist. Resultater: In silico-analysene var spesifikke for alle de fem nydesignede primersettene, men ved PCR-forsøk med et panel på seks andre stafylokokkspecies var kun primerassay hsp60 og rpoB spesifikke ved EvaGreen-deteksjon av PCR-produkt. Sensitiviteten til primerassay rpoB og hsp60 ble beregnet til 9,9 CFU per PCR-reaksjon og har en amplifikasjonseffektivitet på 1,04 (rpoB) og 0,88 (hsp60). PCR med TaqMan-probe og primerassay hsp60 er kjørt med kliniske prøver, både vevsprøver og blodkulturer, og er vist spesifikt for S. epidermidis. Fortolkning: PCR er testet mot et panel med sju stafylokokkspecies og 12 kliniske prøver. Det er derfor knyttet usikkerhet til eventuell kryssreaksjon med andre mikrober og assayet bør valideres bredere før det eventuelt kan tas inn i rutinediagnostikken. Ved fremmedlegemeinfeksjoner er det viktig å påvise agens så raskt som mulig og nydesignet hsp60 PCR-assay med TaqMan-probe kan bli et viktig ledd i å forbedre diagnostikken av S. epidermidis-infeksjoner.