A novel approach to study the impact of reduced brain noradrenergic neuromodulation on transcriptome changes of cortical neurons and astrocytes
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/3140854Utgivelsesdato
2024Metadata
Vis full innførselSamlinger
Beskrivelse
Full text not available
Sammendrag
Noradrenalin (NA) er eit viktig stoff som bidreg til å oppretthalde normal hjernefunksjon. NA er involvert i eit vidt spekter av funksjoner, mellom anna overgangar mellom ulike nivå av aktivitet i hjernen. Den viktigaste kjelda til NA i hjernen er locus coeruleus (LC). Noradrenerge nerveceller i LC frigjev NA gjennom båe synaptisk og volum transmisjon. I tillegg til nerveceller, så uttrykker også astrocytter reseptorar for NA. Astrocytter dekkjer store volum gjennom heile det ekstrasynaptiske området i hjernen, og har blitt foreslått som eit viktig mål for NA. Korleis NA påverke nettverk av nerveceller og åtferd i dyr har blitt nøye studert. Til trass for dette, er det framleis uvisst kva molekylære mekanismar som ligg bak NA sin effekt på sine mål. I dette prosjektet siktar vi mot å etablere ein metode for å deaktivere nerveceller i LC som projiserer direkte til somatosensorisk cortex (SC). Vidare har vi som mål å anvende denne metoden i kombinasjon med sekvensering av RNA frå nerveceller og astrocyttar i SC, for å studere korleis dei blir påverka av redusert NA nevromodulering. For å oppnå følgjande mål har vi tatt i bruk ein mutert reseptor GlyAG for å deaktivere LC nerveceller. GlyAG reseptoren vart målretta mot nerveceller i LC med projeksjonar til SC. For å oppnå dette vart ein strategi for Split-Cre komplementering tatt i bruk, i kombinasjon med rAAV2-retro serotype. GlyAG reseptoren er ein klorid-ionekanal, som vert regulert av medikamentet Ivermectin (IVM), eit vanleg anthelmintika. Ved behandling med IVM vil nerveceller med projeksjonar til SC som uttrykker GlyAG reseptoren bli deaktiverte. Dette vil føre til ein at lokal frigjeving av NA til SC blir redusert. Etter behandling med IVM vart cellekjernar frå nerveceller og astrocyttar i SC isolert og sorter via metoden fluorescens-aktivert celle-kjerne sortering (FANS). Vidare vart RNA frå cellekjerna brukt ekstrahert, og brukt for å sekvensere RNA ved metoden «bulk RNA sequencing». I dette prosjektet demonstrerer vi at det eksperimentelle metoden som vart designa var tilstrekkeleg for å deaktivere nerveceller med bestemde LC-SC projeksjonar. Vi viser også til fleire metodar for å ekstrahere RNA frå nerveceller og astrocyttar frå SC. Totalt sett, så viser desse resultata at vi har etablert ein ny metode for å målretta deaktivere LC nerveceller som projiserer til spesifikke hjerneområde. Denne metoden kan vidare bli tatt i bruk for å studere effekten NA har på genuttrykket til nerveceller og astrocytter i gitt hjerneområde. Noradrenaline (NA) is a crucial player in healthy brain function. The release of NA governs a wide range of global brain state changes. The main source of NA in the brain is the locus coeruleus (LC). LC neurons release NA through both synaptic transmission and global volume transmission. In addition to neurons, brain astrocytes also express various adrenergic receptors. Astrocytes cover large volumes across the extrasynaptic space in the brain, and have been proposed as an important additional target of NA. The effect of NA on neural circuits and animal behavior have been extensively studied. However, the detailed molecular changes at the transcriptomic level of targeted neurons and astrocytes remain poorly understood. In this project we aim to establish a method to target and silence the LC neurons that specifically projects to the somatosensory cortex (SC). This will mimic the effect of reduced local NA release in SC. We further aim to use this method in combination with RNA sequencing to investigate the effect of reduced noradrenergic neuromodulation at the transcriptomic level in neurons and astrocytes in SC. To achieve this, we utilized a mutant human glycine receptor GlyAG as the chemogenetic tool to silence LC neurons. To target the specific LC-SC noradrenergic projections, a Split-Cre complementation strategy combined with rAAV2-retro serotype was also employed. The GlyAG receptor is a chlorine ion channel that is gated by the common anthelminthic drug Ivermectin (IVM). Upon IVM treatment, the targeted LC-SC projection neurons were silenced, and therefore, the local NA release in SC was suppressed. After IVM treatment, nuclei from neurons and astrocytes in SC were isolated and sorted via Fluorescence-activated Nuclei Sorting (FANS). Nuclei RNA was then extracted for bulk RNA sequencing. In this project, we demonstrate that this designed experimental approach was sufficient to target and silence LC-SC projection neurons. We also show various methods to obtain RNA from neurons and astrocytes isolated from SC. Taken together, these results show that we have established a novel approach to target and silence the LC neurons that projects to desired brain regions. This approach can further be used to explore the impact of NA on neuronal and astrocytic transcriptomic profiles in these desired brain regions.