Defensive Behaviors in Juvenile Zebrafish, and the Impact of Serotonergic Manipulation on Their Behavioral Phenotype

Abstract

Det overordnede målet med denne avhandlingen er å utforske forsvarsadferd hos juvenile sebrafisker, med særlig interesse for hvordan manipulering av det serotonergiske systemet påvirker uttrykket av disse adferdsresponsene. Adferdsmønstrene som settes i gang ved frykt og angst utgjør repertoaret av responsmuligheter som er tilgjengelige for å vurdere, forhindre og håndtere stress og oppfattet fare. Ulike situasjoner krever forskjellige responser, og samspillet mellom flere hjerneregioner er nødvendig for å beregne omfanget av en trussel og deretter igangsette den riktige adferdsresponsen. Serotonin er identifisert som en viktig neuromodulator i denne hjernekretsen. Den dorsale rafekjernen er hovedområdet for syntesen og den påfølgende frigjøringen av serotonin, og har innervasjoner til områder i forhjernen og midthjernen som modulerer disse trusselresponsene.

Arbeidet i prosjektet mitt kan inndeles i tre deler. Den første delen besto av en serie optimaliseringstrinn for analysen av defensive adferder hos fritt agerende juvenile sebrafisker. Sebrafisker er i stand til å uttrykke et bredt spekter av adferder, og hjerneanatomien deres har mange fellestrekk med pattedyr grunnet konservering av grunnleggende arkitektur på tvers av virveldyrarter. I den andre delen brukte jeg den forbedrede eksperimentelle protokollen for å kaste mer lys over forholdet mellom det serotonergiske systemet og defensive adferder. For dette formålet undersøkte jeg hvordan kjemogenetisk ablasjon av den dorsale rafekjernen påvirket dyrenes adferdsfenotype. I den siste delen av prosjektet undersøkte jeg forhjerneaktiviteten hos disse ablaterte sebrafiskene. Jeg utførte post-hoc immunfarging av fosforylert versus total ERK-forhold for å måle den nevrale aktiviteten knyttet til den observerte adferden.

Forbedringen av protokollen for adferdseksperimentet avslørte at unike stimuli viste forskjellige evner til å fremkalle defensive reaksjoner hos juvenile sebrafisker. Stimuli med lengre varighet og høyere frekvens virket spesielt godt egnet til å fremkalle sterke stereotypiske defensive responser. Resultatene mine indikerte videre at ablasjon av DR er assosiert med sterkere defensive fenotyper. Mens jeg fant dette mindre konkluderende for novel tank-testen, viste stimulus-testen tydelige forskjeller i den defensive adferden. Her observerte jeg at ablaterte dyr hadde mindre evne til å redusere sin defensive respons etter gjentatt eksponering for stimulusen. Dette forsterker konseptet om at DR og dets serotonergiske innflytelse har en betydelig rolle i å modulere defensive adferder i det aversive hjernesystemet, med andre ord habituering av den adaptive fryktresponsen. ERK-immunfargingsanalysen avslørte en forskjell i hjerneaktivitet mellom ablaterte dyr og kontrolldyr som samsvarte med tidligere laboratoriearbeid på flere områder, men var også forskjellige på andre områder. Her antydet funnene mine at DR-ablasjon førte til redusert nevral aktivitet i forhjernen, bortsett fra den fremre og bakre delen av forhjernen. Samlet sett belyser prosjektet bruken av juvenile sebrafisker som en god tilnærming for å observere og studere defensive adferder. Funn ved bruk av denne tilnærmingen og modellorganismen kan være evolusjonært konservert i virveldyrarter. Dette kan bidra til å utvide forståelsen vår av det serotonergiske systemet hos pattedyr, og muligens til slutt øke den kliniske forståelsen av lidelser knyttet til denne nevrale kretsen.

The overarching aim of this thesis is to explore defensive behaviors in juvenile zebrafish, with a special interest in how manipulation of the serotonergic system influences the expression of these behavioral responses. The behavioral patterns engaged during fear and anxiety make up the repertoire of responses available for assessing, preventing and handling stress and perceived danger. Different situations call for different responses, and the interplay between several brain regions is required for computing the scope of a threat and then execute the appropriate behavioral response. Serotonin has been identified as a key neuromodulator in this circuit. The main site of synthesis and subsequent release of serotonin is the dorsal raphe nucleus, which has innervation to forebrain and midbrain regions modulating these threat responses.

The work in my project can be subcategorized into three parts. The first part consisted of a series of optimization steps for the analysis of defensive behaviors in freely behaving juvenile zebrafish. Zebrafish are capable of expressing a broad range of behaviors, and their brain anatomy shares many traits with mammals due to the conservation of fundamental architecture across vertebrate species. The second part was to make use of the refined experimental protocol to shed more light on the relationship between the serotonergic system and defensive behaviors. For this purpose, I investigated how chemo-genetic ablation of the dorsal raphe affected the animals’ behavioral phenotype. For the last part of the project, I examined the forebrain activity in these ablated zebrafish. I performed post-hoc immunostaining of the phosphorylated- versus total ERK ratio to measure the neuronal activity related to the observed behavior.

Refinement of the behavioral experiment protocol revealed that unique stimuli showed different abilities to elicit defensive reactions in the juvenile zebrafish. Stimuli of longer duration and higher frequency seemed particularly well suited for promoting strong stereotypical defensive responses. Furthermore, my results indicated that ablation of the DR is associated with stronger defensive phenotypes. While I found this to be less conclusive for the novel-tank test, the stimulus delivery test showed prominent differences in the defensive behavior. Here I observed that ablated animals had a reduced capability to attenuate their defensive response after repeated stimuli exposure. This reinforces the concept that the DR and its serotonergic influence has a significant role in modulating defensive behaviors in the aversive brain system, i.e., for the habituation of the adaptive fear response. The ERK immunostaining analysis revealed a difference in brain activity between ablated and control animals that was consistent with previous work in the lab in several areas, but also differed in others. Here, my findings suggested that DR ablation causes decreased neuronal activity in the forebrain except for the anterior and posterior region of the telencephalon. Overall, the project enlightens the use of juvenile zebrafish as a solid approach to observe and study defensive behaviors. Discoveries made with this approach and model organism may be evolutionary conserved in vertebrate species. This would allow us to broaden our understanding of the serotonergic system in mammals, and ultimately perhaps improve our clinical understanding of disorders associated with this neural circuit.