Characterizing the newly generated CamKIIα-Tdg-/- mouse model

Abstract

Tymin DNA glycosilase (TDG) er et enzym som har en viktig rolle i genom reparasjon via fjerningen av T/G uoverensstemmelser. Nyere forskning viser at TDG også har en aktiv rolle i DNA demetylering, noe som tilsier at den og har en rolle i regulering av gen-transskripsjon. Dette er fordi DNA metylering forhindrer bindingen av det transkripsjonelle maskineriet, og kan rekruttere proteiner involvert i genundertrykkelse. Dette fører til genslukking, mens DNA demetylering er assosiert med genuttrykk. Fordi man tror at regulering av DNA metyleringsmønstre er involvert i transkriberings-mekanismer som er essensielle for langtidshukommelse, kan man spørre seg om TDG mediert DNA demetylering er involvert i dannelsen av langtidshukommelse. Denne studien bruker den betingede musemodellen CamKIIα-Tdg-/- for å undersøke om «knockout» av TDG i nevroner i hippokampus fører til endringer eller svekkelse av langtidshukommelse. Jeg brukte immunohistokjemi til å bekrefte Cre-indusert GFP uttrykkelse og antagelig Cre-indusert fjerning av Tdg i alle tre hippokampale regioner (CA1, CA3, DG). Videre evaluerte jeg stedshukommelsen til fullvoksne mannlige CamKIIα-Tdg-/- og LoxP-miniTdg (kontroll) mus ved bruk av etablerte preferansetestene NOL og Y-maze, i tillegg til å måle frykt ved bruk av OFT. I tillegg ble frykt og stedshukommelse vurdert i unge (4 måneder gamle) og eldre (18-19 måneder gamle) LoxP-miniTdg kontroll mus. Til sist optimaliserte jeg adferds-protokollene for å redusere påført stress, redusere tidsbruk, og øke musenes interesse i å utforske den ukjente venstre of kjente høyrearmen i Y-maze. Mine funn tyder på at: 1) Majoriteten av Tdg «knockout» skjer i CA1, hvor over 80% av nevronene er GFP positive, men vi observerer også omfattende GFP uttrykk og antagelig fjerning av Tdg i CA3 og DG, noe som indikerer jevn fjerning av TDG i hippokampus. 2) Selv om vi observerte noe indikasjon i nedgang av preferanse til det ukjente i CamKIIα-Tdg-/- mus sammenlignet med kontroll gruppen, så var differansen ikke signifikant, og inkludering av flere dyr i testene trengs for å vise statistisk differanse. Det er derfor ikke tydelig om fjerning av TDG i nevroner i hippokampus påvirker stedshukommelse. 3) Vi observerte at den eldre gruppen av LoxP-miniTdg musene viste noen indikasjoner på mindre preferanse til det ukjente sammenlignet med den yngre kontroll gruppen, men flere dyr må bli inkludert i testene for å øke testens pålitelighet. 4) Optimalisering av protokollen førte til vellykket inkludering av røde tuneller til transportering av mus fra bur til labyrint, og reduserte antall tilvenningsøkter brukt i Y-maze. I tillegg så vi noen indikasjoner på økt utforskningsaktivitet til høyre of ukjent arm, men inkludering av flere dyr i testen trengs for å øke reliabiliteten.

Thymine DNA glycosylase (TDG) is an enzyme that plays an important role in genome repair through the removal of T/G mismatches. Recent evidence shows that TDG also has an active role in DNA demethylation, suggesting an additional role in transcriptional regulation. This is because DNA methylation hinders the binding of the transcriptional machinery and can recruit gene repression proteins. This leads to gene suppression, while DNA demethylation is associated with gene expression. As regulation of DNA methylation pattern is thought to be involved in transcriptional mechanisms essential for long-term memory, we questioned whether TDG-mediated DNA demethylation would be involved in the formation of long-term memory. In this study, the conditional knockout mouse model CamKIIα-Tdg-/- was used to investigate whether TDG depletion in hippocampal neurons led to alterations or impairments in long-term memory. Firstly, by using immunohistochemistry, I confirmed the Cre-induced GFP expression and presumably Cre-induced-Tdg knockout in all three hippocampal regions (CA1, CA3, and DG). Further, I assessed spatial memory of adult male CamKIIα-Tdg-/- and LoxP-miniTdg (control) mice using the established novelty preference tests Novel Object Location (NOL) and Y-maze, as well as the anxiety levels using the Open Field Test (OFT). In addition, anxiety and spatial memory were assessed in young (4-month-old) and aged (18-19-month-old) LoxP-miniTdg control mice. Lastly, I optimized the behaviour protocols to reduce stress in animals, make the procedure more time-efficient, and increase the interest of animals in the exploration of the novel and familiar right arm in the Y-maze. My findings suggest that: 1) the majority of Tdg knockout occurs in the CA1, with over 80% of the neurons being GFP positive, though we also observe extensive GFP expression and presumable TDG depletion in CA3 and DG, suggesting consistent TDG depletion in the hippocampus. 2) Though some indication of less novelty preference in CamKIIα-Tdg-/- animals compared to the control group was observed, the difference was not significant, and more animals are needed to show statistical difference. It is therefore not clear whether TDG depletion in hippocampal neurons affects spatial memory. 3) We observed that the aged LoxP-miniTdg mice showed some indication of less novelty preference than the young control group indicating impairment in spatial memory, though more animals need to be added to increase reliability. 4) The optimization of the protocol successfully implemented the use of red tunnels to transport mice from cage to maze and reduced the Y-maze habituation sessions. In addition, there were some indications of increased exploratory activity to the right and novel arm, though more animals need to be added to increase reliability.