Statistical Analysis of the Association between MicroRNAs in Breast Milk, Perinatal Probiotic Supplement and the Development of Atopic Dermatitis

Abstract

Studien Probiotics in the Prevention of Allergy among Children in Trondheim (ProPACT) viste en reduksjon på 40% i risikoen for å utvikle atopisk dermatitt for barn der mødrene fikk et probiotisk tilskudd før og mens de ammet, sammenlignet med barn der mødrene fikk et placebo alternativ. De biologiske mekanismene bak denne forebyggende effekten er ennå ikke kjent. I denne masteroppgaven undersøker vi om mikroRNA i morsmelk, målt 10 dager etter fødsel, er mulige bidragsytere til denne risikoreduksjonen. Dette gjør vi ved å utføre to analyser; en der vi undersøker effekten av det probiotiske tilskuddet på mikroRNAene i morsmelken og en der vi undersøker om noen av mikroRNAene i morsmelken er assosiert med utvikling av atopisk dermatitt hos barnet innen fylte 2 år. I tillegg utfører vi en klyngeanalyse for å undersøke mønstre og grupperinger i dataene.

Analysen er basert på data fra 60 mor-barn par utvalgt fra ProPACT-studien, delvis tilfeldig utvalgt og delvis basert på noen seleksjonskriterier. For å undersøke effekten av det probiotiske tilskuddet undersøker vi om individuelle mikroRNA er ulikt uttrykt hos mødrene som fikk probiotika sammenlignet med mødre som fikk en placebo. Denne analysen er basert på den statistiske metoden voom. For å undersøke om det er en assosiasjon mellom mikroRNAene og utvikling av atopisk dermatitt, bruker vi en elastic net regresjonsmodell. Vi undersøker to ulike metoder, nestet kryssvalidering (nested cross-validation) og repetert kryssvalidering (repeated cross-validation), for å bestemme modellparametrene i elastic net modellen. Videre bruker vi den repeterte kryssvalideringen for å estimere konfidensintervall for de estimerte koeffisientene. Dette gjør vi ved å bruke bootstrapping og en metode kjent som accelerated bias-corrected method for å korrigere for bias. I den eksplorative analysen bruker vi hierarkisk klyngeanalyse med både Euklidisk og korrelasjonsbaserte distansemål.

Det probiotiske supplementet er signifikant assosiert med ulike utrykksverdier for ett mikroRNA, miR-577, når vi kontrollerer andelen forventede falske positive til å være 10%, ved å bruke Benjamini og Hochberg metoden. Totalt har 47 mikroRNA en (ikke justert) p-verdi under 0.05, men med unntak av miR-577 har ingen av dem en akseptabel p-verdi etter justering der forventet andel falske positive kontrolleres til å være 10%. Fem mikroRNA er assosiert med utvikling av atopisk dermatitt, dette er miR-342-3p, miR-3605-3p, miR-500a/b-5p, miR-625-3p og miR-6515-5p. Det vil si de har estimerte 95% konfidensintervall som ikke inkluderer null. MikroRNAet miR-3605-3p er også et av mikroRNAene med en (ikke justert) p-verdi under 0.05 i analysen av effekten til probiotika. Klyngeanalysen grupperer miR-3605-3p, miR-6515-5p og miR-577 sammen, noe som indikerer at de er korrelerte. Vi finner altså ett mikroRNA som blir påvirket av det probiotiske tilskuddet og fem mikroRNA som er assosiert med atopisk dermatitt. Vi fant imidlertid ingen bevis for at det probiotiske tilskuddet påvirker de samme mikroRNAene som er assosiert med atopisk dermatitt. To av mikroRNAene assosiert med atopisk dermatitt er imidlertid gruppert sammen med det ene mikroRNAet signifikant påvirket av det probiotiske tilskuddet. Ytterligere studier kan vurdere å fokusere på de mikroRNAene som ser mest lovende ut.

The Probiotics in the Prevention of Allergy among Children in Trondheim (ProPACT) study showed a 40% reduction in the risk of developing atopic dermatitis in children whose mothers received a probiotic supplement before and whilst breastfeeding, compared to children whose mothers received a placebo alternative. The biological explanation for this risk reduction has not yet been fully understood. In this thesis, we analyze if microRNAs in breast milk, measured 10 days postpartum, are possible contributors to the risk reduction. We perform two analyses; one in which we examine the effect of the probiotic supplement on microRNAs and one in which we examine whether any microRNAs are associated with development of atopic dermatitis by 2 years of age. In addition, we perform a clustering analysis to explore patterns and groupings in the data.

The analysis in this thesis is based on data from 60 mother-child pairs which were semi-randomly selected from the ProPACT study. We use differential expression analysis to investigate if the probiotic supplement has an effect on the expression values of individual microRNAs. To perform this analysis we employ the statistical method voom. To investigate whether any microRNAs are associated with the development of atopic dermatitis, we perform variable selection using an elastic net model. We investigate two different methods, nested cross-validation and repeated cross-validation, to find the model parameters of the elastic net model. We proceed with repeated cross-validation to estimate confidence intervals of the coefficients by employing bootstrapping and the accelerated bias-corrected method. In the exploratory clustering analysis, we use hierarchical clustering with Euclidean and correlation based dissimilarity measures.

The probiotic supplement is associated with differential expression of one microRNA, miR-577, when taking into account the multiplicity of tests by controlling the false discovery rate at 10% using the Benjamini and Hochberg method. In total, 47 microRNAs have a raw p-value below 0.05, but except for miR-577, none of them have an acceptable false discovery rate adjusted p-value. The five microRNAs miR-342-3p, miR-3605-3p, miR-500a/b-5p, miR-625-3p and miR-6515-5p are associated with development of atopic dermatitis, i.e. they have an estimated 95% confidence interval that does not include zero. The microRNA miR-3605-3p is also one of the microRNAs with a raw p-value below 0.05 in the analysis of the effect of probiotics. In the cluster analysis miR-3605-3p, miR-6515-5p and miR-577 are grouped together, indicating that they are correlated. In conclusion, one microRNA is found to be affected by the probiotic supplement, and five microRNAs are found to be associated with atopic dermatitis in breast milk at 10 days postpartum. However, we found no conclusive evidence that probiotics affect the same microRNAs that are associated with atopic dermatitis. Two of the miRNAs associated with atopic dermatitis are, however, clustered with the single microRNA found to be affected by the probiotics. Further studies may consider focusing on the microRNAs that were the most promising.