Micro- and mesoscale neuroplasticity of in vitro cortical neuronal networks

Abstract

Bakgrunn: Aksonskade er et kjennetegn ved traumatiske skader tilført sentralnervesystemet (CNS). Pasienter lider ofte av langvarige funksjonsnedsettelser som et resultat av den komplekse patofysiologien assosiert med slike skader, og grunnet mangel på en iboende repareringsevne i det voksne CNS. Nevroplastisitet i CNS kan potensielt utnyttes til å reetablere funksjonsfriskhet. En økt forståelse for mekanismene involvert i aksonskade og nevroplastisitet kan gi ny innsikt til potensielle metoder som har som hensikt å begrense nevrodegenerering og metoder som kan oppfordre til funksjonsfriskhet etter skade. Dette kan igjen bidra til utvikling av mer presise og spesifikke rehabiliteringsstrategier/terapier. Ved bruk av en in vitro tilnærming kan vi øke vår forståelse av aksonskade og studere spesifikke mekanismer ved nevroplastisitet.

Mål: Dette prosjektet var delt inn i tre eksperimenter. Målet for eksperiment 1 var å utforske aspekter ved in vitro kortikal aksonskade og evaluere effekter av ekstracellulær stimulering med γ-aminobutyric acid (GABA) etter aksotomi, ved bruk av mikrofluidiske brikker. Målet for eksperiment 2 var å stimulere in vitro kortikale nettverk med gjentatt «tetanisk stimulering» (TS) levert gjennom en sentral elektrode på mikroelektrode-matriser (MEAer) for så å estimere nettverkenes nevroplastiske responser. Målene for eksperiment 3 var å spesifikt styrke en bestemt funksjonell forbindelse innen kortikale nettverk kultivert på mikrofludiske MEAer ved levering av elektriske pulser til en presynaptisk så postsynaptisk nettverksnode. I tillegg hadde vi som mål å estimere potensielle endringer i akson-signalisering i respons til den samme stimuleringen.

Resultater: Ingen aksoner var observert i mikrokanalene som kobler cellekamrene i de mikrofluidiske brikkene over tre uker med monitorering (eksperiment 1). Kortikale nettverk justerte styrken på spesifikke funksjonelle koblinger etter fokal TS (eksperiment 2). Endringene var svært uforutsigbare ettersom både retningen (potensering vs. depresjon) og omfanget (antall endrede koblinger) av endringene varierte mellom de kortikale nettverkene. Vi fant at aksoner kan øke sin forplantningshastighet og signal amplitude som et resultat av elektrisk stimulering (eksperiment 3). Disse endringene ble observert både rett etter og tre dager etter stimulering. Stimuleringen resulterte i tillegg til en økning i korrelasjon mellom aktiviteten til de to stimulerte nettverksnodene.

Diskusjon: Den første delen av diskusjonen fokuserer på potensielle forklaringer på mangelen av aksoner i mikrokanalene (eksperiment 1). Videre diskuteres potensielle forklaringer på de varierte responsene til TS mellom de ulike kortikale nettverkene (eksperiment 2). Med henhold til eksperiment 3 diskuteres ulike mekanismer som kan ligge til grunn for de kort- og langvarige endringene i akson-signalisering etter stimulering, i tillegg til den observerte økningen i korrelert aktivitet mellom de to stimulerte nodene. Funksjonelle betydninger av endringer i akson-signalisering blir også utforsket. Den siste delen av diskusjonen tar for seg betydningen resultatene kan ha i lys av til skade.

Konklusjon: Evaluering av potensielle effekter av GABA-stimulering etter in vitro kortikal aksotomi gjenstår for fremtidig forsking. Resultatene fra eksperiment 2 understreker kompleksiteten ved nervroplastisitet i CNS, mens eksperiment 3 viser at det er mulig å styrke bestemte funksjonelle koblinger innen et in vitro kortikalt nettverk. Resultatene fra eksperiment 3 foreslår i tillegg at aksoner kan være et mål i stimuleringsbaserte rehabiliteringsstrategier. Resultatene fra dette prosjektet er et bidrag til forskning hvis mål er økt forståelse av nevroplastisitet i CNS på mikro- og mesoskala.

Background: Axonal injury is a hallmark of traumatic central nervous system (CNS) injuries. Patients often suffer from prolonged functional deficits due to the complex pathophysiology associated with such injuries, as well as due to the lack of intrinsic repair mechanisms in the adult CNS. Importantly, mechanisms of CNS neuroplasticity can potentially be harnessed to promote functional gain. A greater understanding of both CNS axonal injury and neuroplasticity can offer new insights into potential ways of limiting neurodegeneration and promoting functional gain after injury. This, again, can contribute in the development of more accurate and targeted rehabilitation strategies/therapies. One way to increase our understanding of axonal injury and specific mechanisms of neuroplasticity is by using an in vitro reductionist approach.

Aims: The current project was divided into three experiments. The aim of experiment 1 was to investigate aspects of in vitro cortical axonal injury and the effects of extracellular γ-aminobutyric acid (GABA) addition post axotomy, by the use of microfluidic chips. The aim of experiment 2 was to assess the neuroplastic responses of in vitro cortical networks to repetitive tetanic stimulation (TS) delivered through one fixed central electrode on microelectrode arrays (MEAs). The aims of experiment 3 were to specifically strengthen targeted functional connections within in vitro cortical networks cultured on microfluidic MEAs, by using a paired pulse stimulation protocol, and to assess potential alterations in axonal signalling in response to the same stimulation.

Results: No axonal growth was observed within the microtunnels connecting the cell compartments of the microfluidic chips over three weeks of monitoring (experiment 1). Repetitive TS altered the strength of specific functional connections within cortical networks. However, the alterations were highly unpredictable as both the nature (potentiation vs. depression) and the magnitude (nr. of altered connections) varied between the different cortical networks (experiment 2). Both axonal propagation velocity and peak spike amplitude increased as a result of the paired pulse stimulation. The observed alterations were noticed both immediately after stimulation and three days after stimulation. In addition, the paired pulse stimulation resulted in increased correlated activity between the stimulated node pair (experiment 3).

Discussion: The first part of the discussion focuses on potential explanations for the lack of axonal growth through the tunnels of the axotomy chip (experiment 1). Next, possible explanations for the observed variability in cortical network responses to TS is explored (experiment 2). In relation to experiment 3, potential mechanisms involved in both the observed short-term and long-term alterations in axonal signalling and the increase in the correlated activity between the stimulated node pair are discussed. Furthermore, the functional effects of altered axonal signalling are considered. The last part of the discussion focuses on the significance of the results within the frame of CNS traumatic injuries.

Conclusion: Assessment of the effects of GABA addition after in vitro cortical axotomy is left for future investigations. Experiment 2 emphasises the complexity of CNS neuroplasticity, while experiment 3 shows the potential for targeted strengthening of specific connections within a network. In addition, the results from experiment 3 suggests that axons may be a relevant target in stimulation-induced rehabilitation. All in all, the current findings add to the body of research aiming to increase our understanding of both micro- and mesoscale neuroplasticity.