Identification and characterization of long noncoding RNAs involved in the cell cycle

Abstract

Lange ikke-kodende RNA involvert i cellesyklus For å produsere nye celler må kroppens celler dele seg til to identiske kopier i en prosess som kalles cellesyklus. Dette er en nøye kontrollert prosess for å sikre at eventuelle feil som oppstår under celledeling blir detektert og reparert. Hvis skaden er uopprettelig igangsetter cellen programmert celledød for å hindre at feil overføres til dattercellene. Feil i DNA som gir vekstfremmende egenskaper kan føre til kreft, som i dag er den sykdommen som fører til flest dødsfall i Norge med hele 11041 tilfeller i 2019. Utviklingen av sekvenserings-teknologi på begynnelsen av 2000-tallet avslørte at mesteparten av det humane genomet blir transkribert og tusenvis av ikke-kodende RNA ble detektert. Lange ikke-kodende RNA er transkripter som er lenger enn 200 nukleotider og blir vanligvis ikke translatert til protein. I dag er det identifisert totalt 84485 ikke-kodende transkript, 48684 av disse er lange ikke-kodende RNA. De siste femten årene er det vist at mange av de lange ikke kodende RNA har viktige funksjoner i cellene, der de er involvert i flere ulike biologiske prosesser inkludert cellesyklus, genregulering, utvikling, differensiering og X-kromosominaktivering. En stor andel av de lange ikke-kodende RNA er celletype-spesifikke, i tillegg til at de ofte er dysregulert i kreft, noe som tyder på at enkelte av disse kan være mulige biomarkører med prognostisk og terapeutisk potensiale. Det er kjent at lange ikke-kodende RNA er involvert i regulering av cellesyklus, men det gjenstår fortsatt mye for å kunne identifisere alle lange ikke-kodende RNA som har generelle og patogene roller knyttet til cellesyklus, samt de molekylære mekanismene knyttet til funksjonen. I artikkel 1 benyttet vi en kombinasjon av ulike metoder for å identifisere lange ikke-kodende RNA involvert i cellesyklus. Vi gjorde cellesyklus-synkronisering av en human keratinocytt cellelinje (HaCaT), etterfulgt av RNA-sekvensering og ChIP-sekvensering. Totalt identifiserte vi 1009 gener som ble aktivt transkribert i ulike faser av cellesyklus, hvorav 59 var lange ikke-kodende RNA. For fire av disse, SNHG26, EPB41L4A-AS1, RP11-132A1.4 og ZFAS1, undersøkte vi videre funksjon og fant at alle fire påvirket vekst og fasefordeling i cellesyklus i flere ulike cellelinjer. Metoden vi benyttet i artikkel 1 viste seg å være svært nyttig for å identifisere cellesyklus-assosierte gener. I artikkel 2 og 3 foretok vi en grundigere funksjonell evaluering av henoldsvis SNHG26 og EPB41L4A-AS1, som var to av de lange ikke-kodende kandidatene vi identifiserte i artikkel 1. Siden det er RNA som utøver funksjonen, vil kjennskap til den subcellulære lokaliseringen av SNHG26 og EPB41L4A-AS1 kunne gi viktig informasjon om mulige biologiske funksjoner. Vi brukte derfor RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) for å bestemme den subcellulære lokaliseringen til begge de lange ikke-kodende kandidatene. Resultatene viste at SNHG26 hovedsakelig er lokalisert i kjernen, med to til fem høy-intensitets punkter, i tillegg til lavintensitets punkter i cytoplasma i tre ulike cellelinjer. Når vi analyserte mitotiske HaCaT celler, observerte vi at høy-intensitets punkter forsvant, mens det i stedet oppstod lav-intensitets punkter co-lokalisert med DNA. Vi kan derfor ikke utelukke at SNHG26 kan ha funksjoner knyttet til for eksempel epigenetisk nedarving. EPB41L4A-AS1 er lokalisert både i kjerne og cytoplasma i HaCaT celler, med varierende intensitet. Videre brukte vi CRISPR inhibering og CRISPR aktivering til å henholdsvis nedregulere og øke transkripsjonen til SNHG26 og EPB41L4A-AS1 for å se om vi kunne reprodusere effekten på cellesyklus og vekst fra artikkel 1, samt undersøke underliggende mekanismer. I artikkel 2 viste vi at nedregulering av SNHG26 påvirket både vekst og fasefordeling i cellesyklus på samme måte som i artikkel 1, mens oppregulering av SNHG26 ga motsatt effekt. I tillegg viste vi at effekten SNHG26 har på fasefordeling var stabil over tid. Vi viste også at reduksjon i SNHG26 hadde ulik effekt i ulike celletyper. Dette tyder på at celletype-spesifikke gener og mutasjoner gir en annen fenotypisk effekt eller ulike funksjonelle mekanismer i ulike celletyper. I artikkel 3 viste vi at nedregulering av EPB41L4A-AS1 påvirket fasefordeling i cellesyklus som i artikkel 1, og at oppregulering av EPB41L4A-AS1 ga motsatt effekt. Nedregulering og oppregulering av EPB41L4A-AS1 resulterte i ulik fasefordeling i HaCaT og lungekreft celler (A549), noe som tyder på at også EPB41L4A-AS1 har celletype-spesifikke funksjoner. Mange lange ikke-kodende RNA regulerer uttrykket av sine nabogener. For å undersøke om dette også gjaldt våre kandidater brukte vi CRISPR til å endre uttrykket av SNHG26 og EPB41L4AAS1 etterfulgt av RT-qPCR for å måle om utvalgte nabogen ble påvirket. Både SNHG26 og EPB41L4A-AS1 påvirket uttrykket av sine nabogen, henholdsvis TOMM7 og EPB41L4A, noe som tyder på en mulig cis-regulering. Videre gjorde vi RNA-sekvensering for å få en bedre forståelse av de funksjonelle mekanismene til SNHG26 og EPB41L4A-AS1. For SNHG26 identifiserte vi differensielt uttrykte gener som var motsatt uttrykt i respons til CRISPR inhibering og CRISPR aktivering i HaCaT celler. Kjente cellesyklus-assosierte gener var differensielt uttrykt, og felles for flere av disse er at de er indirekte eller direkte regulert av MYC. MYC er et onkogen som kan forårsake kreft ved å påvirke cellesyklus og proliferasjon gjennom regulering av ulike gener. En analyse av de fem mest signifikante genene støttet at SNHG26 er involvert i reguleringen av cellesyklus. Genuttrykks-analyser av CRISPR-mediert nedregulering av EPB41L4A-AS1 i HaCaT og A549 celler identifiserte henholdsvis 1612 and 1371 differensielt uttrykte gener, og genontologi terminologier inkluderte vekstfremmende signalveier. I denne avhandlingen benyttet vi en kombinasjon av metoder som er spesielt egnet til å identifisere cellesyklus-assosierte gener. Basert på resultatene foretok vi funksjonelle og mekanistiske analyser av to lange ikke-kodende RNA, som viser at både SNHG26 og EPB41L4AAS1 har vekstfremmende egenskaper. Funnene våre støtter at de molekylære mekanismene er interessante for videre undersøkelser i forhold til fremtidig klinisk potensiale.