Towards modeling of neuronal networks in HUWE1-induced XLID

Abstract

Intellektuell forstyrrelse (ID) er en utviklingsforstyrrelse karakterisert av manglende intellektuelle funksjoner og adaptive evner. Denne lidelsen rammer tilnærmet 2% av den vestlige populasjonen. X-koblet ID (XLID) er en underkategori av ID forårsaket av mutasjoner langs X kromosomet. Økende evidens indikerer at mutasjoner i X kromosom-genet HUWE1 (HECT, UBA, and WWE domain-containing 1) fører til XLID. HUWE1 er en E3 ubikvitinligase som regulerer flere essensielle cellulære prosesser, inkludert proliferasjon og differensiering av nevroner, presynaptisk GABAergisk nevrotransmisjon og p53-indusert apoptose. Juberg-Marsidi syndrom (JMS) er den mest alvorlige formen for HUWE1-indusert XLID. Selv om HUWE1-mutasjoner er tydelig assosiert med XLID er kunnskapen rundt mekanismene som forårsaker lidelsen mangelfull, og lidelsen er foreløpig ikke mulig å behandle. Nylige funn fra laben vår antyder at økt p53-signalisering er en prosess som underligger HUWE1-indusert XLID. I hvilken grad p53-signalisering påvirker nevronal funksjon i JMS er uvisst. Fremveksten av nye og effektive metoder for å generere spesifikke underpopulasjoner av kortikale nevroner, gjennom reprogrammering av menneskelige induserte pluripotente stamceller (hiPSCer) med transkripsjonsfaktorer, har åpnet for nye måter å modellere nevrale nettverk i helse og sykdom. I denne masteroppgaven har jeg som mål å (i) generere GABAergiske og glutamaterge nevronale populasjoner fra friske (WT) og JMS-pasient-spesifikke iPSCer, og så bruke disse til (ii) å modellere nevronale nettverk for WT og HUWE1-indusert XLID. JMS og WT GABAergiske og glutamaterge nevroner ble indusert fra hiPSCer ved hjelp av lentivirus-vektorer som kodet for Achaete-scute homolog 1 og Distal-Less homeobox 2, og Neurogenin 2, respektivt. På dag 29 og 74 etter indusering ble celler samlet for analyse. Markører for p53-aktivitet, HUWE1, og nevronal modning, identitet og funksjon ble analysert ved hjelp av immunofluorescence (IF)- og RT kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR)-baserte metoder, på dag 29 og 74 etter indusering. Både IF og RT-qPCR indikerte at nevronale markører var oppregulert i både JMS og WT nevroner sammenlignet med hiPSCer. Det var en trend for HUWE1-nivåer å være lavere og p21 å være høyere i JMS-nevroner sammenlignet med WT. Signifikansen av disse funnene gjenstår å bli avklart gjennom økning i antall eksperimentelle replikaer. Covid-19-pandemien forhindret repetisjon av disse langtidseksperimentene, og vanskeliggjorde elektrofysiologiske opptak av nettverkene. Resultatene av denne oppgaven har etablert betingelser for effektiv generering av forskjellige undertyper av nevroner. Dette er et viktig steg mot videre modellering av nevronale nettverk i HUWE1-indusert XLID. Ved å forstå karakteristikker ved nevronale nettverk kan man videre undersøke klinisk relevante genotype-fenotype forhold i HUWE1-indusert XLID.

Background. Intellectual disability (ID) is a neurodevelopmental disorder characterized by impairment of intellectual functions and adaptive behavior. It affects approx. 2% of the Western population. X linked ID (XLID) is a subset of IDs caused by mutations in genes along the X chromosome. Increasing amount of evidence indicates that mutations in the X chromosome gene HUWE1 (HECT, UBA, and WWE domain-containing 1) lead to XLID. HUWE1 is an E3 ubiquitin ligase which regulates numerous essential cellular processes including neural differentiation and proliferation, presynaptic GABAergic transmission, and p53-induced apoptosis. The Juberg-Marsidi syndrome (JMS) is the most severe form of HUWE1-induced XLID. Although HUWE1 mutations are clearly associated with XLID, knowledge is limited about the mechanisms that cause the disease and it is currently untreatable. Recent work conducted in our lab suggested that increased p53 signaling is a common process underlying HUWE1-induced XLID. To which extent increased p53 signaling impacts neuronal functioning in JMS remains unknown. The advent of new and efficient methods for generating specific subtypes of cortical neurons, through transcription factor reprogramming of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), allows for new ways of neuronal network modeling in health and disease. Aims. In this thesis project, I aim to (i) generate from iPSCs healthy (WT) and JMS patient-specific GABAergic and glutamatergic neural populations, and use those to (ii) model WT and HUWE1-induced XLID neuronal networks. Methods. JMS and WT GABAergic and glutamatergic neurons were induced from hiPSCs using lentiviral vectors encoding Achaete-scute homolog 1 and Distal-Less Homeobox 2, and Neurogenin 2, respectively. Markers of p53 activity, HUWE1, and neuronal maturation, identity, and function were analyzed using immunofluorescence (IF) and RT quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) based methods, at day 29 and 74 of induction. Results. Both IF and RT-qPCR showed that neuronal markers were upregulated in both JMS and WT neurons compared to hiPSCs. There was a trend for HUWE1 levels to be lower and p21 levels to be higher in JMS neurons compared to WT. The significance of these findings remains to be further determined through increase in number of experimental replicas. The Covid-19 pandemics hindered repetitions of these long-term experiments, as well as compromised neuronal network recordings. Conclusions. The results of this thesis have established conditions for efficient generation of different neuronal sub-types. This is an important step towards further modeling of neuronal networks in HUWE1-induced XLID. Understanding features of neuronal networks will allow probing of clinically relevant genotype-phenotype relationships in HUWE1-induced XLID.