Revalorization of agar from red seaweed as microbial feedstock for Corynebacterium glutamicum
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/3104192Utgivelsesdato
2023Metadata
Vis full innførselSamlinger
Sammendrag
I dag er mikrobiell fermentering hovedsakelig basert på bruk av sukker som karbonkilde, hvilket kan virke begrensende når det kommer til bærekraft og konkurrerende bruk av sukker som kilde for menneske- og dyrenæring. Biomasse fra rødt sjøgress har et rikt og mangfoldig innhold av polysakkarider, som for eksempel agar, med potensiale for utnyttelse som et bærekraftig alternativ til mikrobielt råstoff. Imidlertid har potensialet for å bruke agar som karbonkilde innen bioteknologi ennå ikke blitt realisert. Denne masteroppgaven hadde som mål å legge grunnlaget for å utvikle cellefabrikker som kan utnytte agar. Derfor ble bakterien Corynebacterium glutamicum, som er mye brukt innen bioteknologi, valgt for produksjon og utskillelse av agar-nedbrytende enzymer. En toksisitetstest ble utført for å vurdere C. glutamicums evne som vertsbakterie for agaraser. Resultatene viste at en konsentrasjon på 0.4 g/L agar var uegnet for vekst under de testede forholdene. Videre ble C. glutamicum modifisert ved hjelp av tradisjonelle molekylære teknikker for å etablere produksjon og utskillelse av de tre utvalgte agarasene: AhgA fra Zobellia galactanivorans samt DagA og DagB fra Streptomyces coelicolor. Mikrobiell vekst, produksjon av proteiner og nedbrytning av agar ble evaluert. Resultatene viste at supernatanten fra C. glutamicum-stammen som overuttrykte ahgA og dagA, kjent som CgAAopt, viste økning på 4.5 i konsentrasjonen av utskilte proteiner, og oppnådde vellykket nedbrytning av agar etter 24 timers inkubasjon. Dermed ble stammen CgAAopt videre modifisert for å kunne ta opp og utnytte galaktose ved å over-uttrykke galETKM-operonet sammen med genet galP for galaktosepermease fra Escherichia coli. Dette resulterte i stammen ved navn CgGalAAopt. Likevel ble det ikke observert vekst når CgGalAAopt ble testet med agar som eneste karbonkilde. De kvalitative resultatene fra dette arbeidet antydet lav effektivitet ved nedbrytning av agar og dermed ingen dannelse av agar-avledet galaktose. Derimot ble nedbrytning av agar av de konstruerte stammene visuelt bekreftet. Oppsummert legger resultatene fra denne studien grunnlaget for videre forskning for å optimalisere strategier for nedbrytning og utnyttelse av agar, og dermed etablering av rødt sjøgress som et alternativt og kompetent mikrobielt råstoff. Today, the predominant reliance on sugar-based fermentation poses limitations in terms of sustainability and carbon source availability across various industries. In this regard, red seaweed biomass is abundant and rich in diverse polysaccharides that can potentially be fermented as sustainable alternative microbial feedstock, as for instance agar. However, the utilization of agar as carbon source in biotechnology remains unestablished. This master’s thesis aimed to lay the foundation of agar utilizing cell-factories. Hence, the biotechnology workhorse Corynebacterium glutamicum was chosen for the production of secreted agarases. A toxicity test was conducted to assess the robustness of C. glutamicum as an expression host for agar degradating enzymes; results revealed that a concentration of 0.4 g/L agar was unsuitable for growth among the tested conditions. Next, C. glutamicum was engineered via traditional molecular techniques to establish production and secretion of three agarases of interest, namely AhgA from Zobellia galactanivorans, as well as DagA and DagB from Streptomyces coelicolor. Microbial growth, protein production, and agar degradation were evaluated, concluding that the supernatant from the C. glutamicum strain overexpressing ahgA and dagA, namely CgAAopt, exhibited 4.5-fold increase in secreted protein concentration and achieved successful agar degradation after 24 hours of incubation. Additionally, the strain CgAAopt was further engineered to enable galactose uptake and utilization by overexpression of the galETKM operon along with the galactose permease gene galP from Escherichia coli, yielding the strain CgGalAAopt. However, when testing CgGalAAopt with agar as sole carbon source no growth was observed. The qualitative results of this work suggested low efficiency of agar degradation and, hence, no agar-derived galactose was formed. Nevertheless, agar degradation by these strains was visually confirmed. Concluding, the outcomes of this study pave the way for further research to optimize agar degradation and utilization strategies, ultimately establishing red seaweed alternative and competent microbial feedstock.