Identification of Potential Cellular Pathways Involved in Mediating the Rapid Bactericidal Effects of the Novel β-clamp-targeting Antimicrobial Peptide Betatide
Description
Full text not available
Abstract
Økende antimikrobiell resistens, samt redusert utvikling av nye antibiotika, har ført til en global utfordring som innebærer en stor økonomisk og sosial belastning. Betatide er et nytt antimikrobielt peptid som binder til den bakterielle DNA sliding clampen, β-clamp. Denne bindingen hindrer DNA replikasjon og utviklingen av resistens ettersom den hemmer såkalte translesion syntese polymeraser som lager mange mutasjoner. Betatide har en rask bakteriedrepende effekt i både eksponentiellfase og stasjonærfase kulturer, noe som ikke direkte kan forklares av peptidets blokkering av replikasjon. For å identifisere mekanismer som kan forklare denne effekten, ble det gjort et screen av Keio kolleksjonen, som er en samling av nesten 4000 ikke-essensielle enkelt gen knockouts i Escherichia coli (E. coli). Identifisering av knockoutstammer som er mindre sensitive mot betatide enn villtype E. coli kunne gi en indikasjon på celleprosessene som er involvert i betatide sin bakteridrepende effekt. Innledende data hadde identifisert 82 mutante stammer som var mindre sensitive mot betatide. I dette prosjektet, ble tre typer overlevelses analyser brukt for å verifisere at disse stammene var mindre sensitive: i) et resazurin-basert assay, ii) et minimum inhibitory concentration (MIC) assay og iii) et time-kill assay. Disse forsøkene verifiserte at 14 av de opprinnelige 82 mutante stammene var mindre sensitive mot betatide enn villtypen. Gen anriknings analyse av både de første og de verifiserte mutante stammene indikerte at purin metabolisme var involvert. Resazurin assayet viste imidlertid ikke noe effekt på overlevelse når puriner (adenosin og adenin) ble tilsatt bakterier sammen med betatide. Betatide behandling førte til en økning av reaktive oksygen substanser (ROS) i bakteriene (målt med 2’-7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate). At ROS er involvert i betatide sin bakteriedrepende effekt, ble også vist ved at ROS scavengeren dimetylsulfoksid hadde en beskyttende effekt. Induksjon av for mye ROS er foreslått som en felles mekanisme for antibiotika-indusert celledød. Sterk reduksjon av intracellulære puriner, som fører til en overaktiv metabolisme, har blitt foreslått som en årsak til høyt nivå av ROS. Om økningen i ROS etter betatide behandling funnet i dette studiet skylder den årsaken, trenger videre studier, men mindre ROS ble detektert i mindre sensitive mutanter (ΔcyaA and ΔpurC) som har mindre mulighet til å «skru opp» purin syntesen. The development of antimicrobial resistance and a stalling in the discovery of new antibiotic drugs presents a global issue entailing a large economic and social burden. Betatide is a novel antimicrobial peptide that targets the bacterial DNA sliding clamp, the β-clamp, inhibiting DNA replication as well as the development of resistance by blocking error-prone translesion synthesis polymerases. Betatide also exhibits a rapid bactericidal effect in both exponentially growing and stationary bacterial cultures, which cannot be directly explained by its blocking of replication. To identify mechanisms which can explain this effect, a screen was performed on the Keio collection, which comprises almost 4000 nonessential single-gene knockouts in Escherichia coli (E. coli). Identifying knockout strains less sensitive to betatide than wild type E. coli could give an indication of which cellular processes are involved in betatide’s mode of action. Initial data had identified 82 less-sensitive mutant strains. In this project, three types of cell viability assays were employed to verify these hits: i) a resazurin-based assay, ii) a minimum inhibitory concentration (MIC) assay, and iii) a time-kill assay. These assays verified that 14 of the 82 initial hits were less sensitive to betatide than wild type. Gene enrichment analysis of both the initial and verified hits indicated an involvement of purine metabolic pathways. However, resazurin-based cell viability assays did not show an effect of supplemented purines (adenosine and adenine) on the viability of betatide-treated bacteria. Furthermore, increased reactive oxygen species (ROS) were shown to be associated with betatide-induced death; a significant increase in ROS post-betatide treatment was shown using the 2’-7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate probe and the ROS scavenger dimethyl sulfoxide had a protective effect on betatide-treated bacteria. Excessive ROS has been implicated as a common contributor to antibiotic-induced death, with depletion of purine pools leading to an overactive metabolism as one hypothesized mechanism. Whether the increase in ROS post-betatide treatment found in this study is due to this hypothesized mechanism requires further investigation; however, lower ROS production was detected in less-sensitive mutants (ΔcyaA and ΔpurC), which have a reduced ability to ‘drive up’ their purine biosynthesis.