Establishing a Protocol for Quantification of Proteins in Biomass Samples

Abstract

Når man driver med forskning på ulike organismer er det viktig å ha representative referanser å sammenligne resultatene med. Idag blir det meste forskning sammenlignet med data fra modell organismer, eller organismer med liknende trekk, hvis data for organismen man ønsker å studere ikke er tilgjengelig. Systembiologi er er felt innen forskning som prøver å utvikle bedre muligheter for gode sammenligningsgrunnlag, ved å lage beregningsbaserte modeller, som for eksemel genomskal modeller, for prediksjon av feks metabolisme. Det er avgjørende at det finnes gode, eksperimentelle data å basere disse genomskalamodeller på. De beregningsbaserte modellene har som mål å simulere hele det metabolske systemet til en organisme, og deretter predikere de metabolske fenotypene til organismen. Disse modellene kan derfor bli brukt til å lage biologiske hypoteser om organismer. Biomasse sammensetningen til en organisme blir påvirket av vekstrate, og organismen har mulighet til å endre på dens metabolisme for å nyttigjøre seg mest mulig av næringsstoffene i miljøet den lever i. Modellprediksjoner til såkalte modell organismer i visse standard miljøer vil derfor sannsnyligvis ikke være representative for andre liknende organismer, eller til og med ikke for den samme organismen i et annet miljø. På grunn av dette, vil det være bedre å ha gode eksperimentelle data å støtte GEM modellene på. I dette prosjektet har jeg valgt å fokusere på å forbedre en metode som kan brukes for å estimere protein og aminosyre innhold i biomasse prøver. Først ble det gjennomført et grundig litteratur studie, hvor fokuset lå på ulike hydrolyse metoder for å klargjøre biomasse prøver til analyse ved bruk av High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). Vi bestemte oss for å teste to ulike metoder. De to metodene valgt var å bruke 6 M hydrogenklorid (HCl) eller 4 M metansulfonsyre (MSA). Begge hydrolysemetoder ble kjørt på 105 ◦C i 24 timer og deretter klargjort for videre HPLC analyse. Begge metodene ble grundig evaluert ved å kjøre hydrolyse på ulike typer prøver, både rene amino syrer og proteiner (lysozym), og biomasseprøver av Escherichia coli (E. coli) og Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Vi klarte å kvanitfisere og analysere 17 av de 20 vanlige aminosyrene. Hydrolysemetoden som brukte 6 M HCl ga jevnt over de beste resultatene, men det var tydelig at det sannsynligvis er matriseeffekter som foregår i biomasseprøvene som gjør at ulike komponenter reagerer med hverandre under hydrolysen. Metoden som brukte 6 M HCl ble videre testet på prøver av E. coli som ble dyrket frem med ulike karbonkilder og med ulike vekstrater. Resultatene viste at det er en forskjell i det totalte aminosyre innholdet i prøvene med samme karbonkilde men med ulike vekstrater. I tillegg ble det observert en forskjell i aminosyre sammensetningen mellom prøvene dyrket med forskjellige vekstrater.

When doing research, it is important to have accurate references to compare the results to. Today, most research is compared to data from model organisms, or similar organisms to the one studied if data for the organism in question do not exist. Systems biology is a field that try to make better options for this by making good, computational models, such as Genome Scale Metabolic Models (GEMs), for prediction of for example metabolism. It is crucial to have accurate experimental data to base the GEMs on. The computational models try to simulate the entire metabolic system of an organism, and thereby predict the metabolic phenotypes of organisms. It can therefore be used to make biological hypotheses about the organism. The biomass composition of an organism varies with the growth rate, and the organism might adapt its metabolism to take better advantage of the nutrients available in its environment. The model prediction for the so called model organism in certain standard environments are most likely not representable for similar organisms, or even the same organism under different conditions. Because of this, it would be good to have experimental data to support the GEMs, and in this project I focused on improving the method to obtain experimental data of the protein and amino acid part of the biomass composition. A thorough literature study was carried out, to get knowledge on relevant methods for protein hydrolysis, and what methods would be able to test at our lab. The focus in the litterature study was on the hydrolysis part which is typically carried out before analysis of amino acids with High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). We decided to test two different methodsfor hydrolysis, one using 6 M hydrochloric acid (HCl) and the other using 4 M methanesulfonic acid (MSA) for 24 hours at 105 ◦C. Both methods were tested on a variety of samples, both pure amino acids and proteins (lysozyme), and biomass samples of Escherichia coli (E. coli) and Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). We were able to quantify and analyse 17 of the 20 common amino acids. The hydrolysis method using 6 M HCl showed overall better recoveries of most amino acids, but it was obvious that there might be some matrix effects going on in the samples during hydrolysis. The method using HCl was further evaluated on samples of E. coli grown with different carbon sources and at different growth rates. The results showed that there is a difference in the total amino acid content of the different growth rates of the samples grown with the same carbon source. In addition, it showed that there was a difference in the amino acid composition between the samples grown with different carbon sources.