Establishing a Protocol for Quantification of Proteins in Biomass Samples
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/3042814Utgivelsesdato
2022Metadata
Vis full innførselSamlinger
- Institutt for biologi [2514]
Beskrivelse
Full text not available
Sammendrag
Når man driver med forskning på ulike organismer er det viktig å ha representative referanser åsammenligne resultatene med. Idag blir det meste forskning sammenlignet med data fra modellorganismer, eller organismer med liknende trekk, hvis data for organismen man ønsker å studereikke er tilgjengelig.Systembiologi er er felt innen forskning som prøver å utvikle bedre muligheter for gode sammenligningsgrunnlag, ved å lage beregningsbaserte modeller, som for eksemel genomskal modeller, forprediksjon av feks metabolisme. Det er avgjørende at det finnes gode, eksperimentelle data åbasere disse genomskalamodeller på. De beregningsbaserte modellene har som mål å simulere heledet metabolske systemet til en organisme, og deretter predikere de metabolske fenotypene til organismen. Disse modellene kan derfor bli brukt til å lage biologiske hypoteser om organismer.Biomasse sammensetningen til en organisme blir påvirket av vekstrate, og organismen har mulighettil å endre på dens metabolisme for å nyttigjøre seg mest mulig av næringsstoffene i miljøet den leveri. Modellprediksjoner til såkalte modell organismer i visse standard miljøer vil derfor sannsnyligvisikke være representative for andre liknende organismer, eller til og med ikke for den samme organismen i et annet miljø. På grunn av dette, vil det være bedre å ha gode eksperimentelle data åstøtte GEM modellene på. I dette prosjektet har jeg valgt å fokusere på å forbedre en metode somkan brukes for å estimere protein og aminosyre innhold i biomasse prøver.Først ble det gjennomført et grundig litteratur studie, hvor fokuset lå på ulike hydrolyse metoderfor å klargjøre biomasse prøver til analyse ved bruk av High-Performance Liquid Chromatography(HPLC). Vi bestemte oss for å teste to ulike metoder. De to metodene valgt var å bruke 6 M hydrogenklorid (HCl) eller 4 M metansulfonsyre (MSA). Begge hydrolysemetoder ble kjørt på 105 ◦Ci 24 timer og deretter klargjort for videre HPLC analyse.Begge metodene ble grundig evaluert ved å kjøre hydrolyse på ulike typer prøver, både rene aminosyrer og proteiner (lysozym), og biomasseprøver av Escherichia coli (E. coli) og Saccharomycescerevisiae (S. cerevisiae).Vi klarte å kvanitfisere og analysere 17 av de 20 vanlige aminosyrene. Hydrolysemetoden sombrukte 6 M HCl ga jevnt over de beste resultatene, men det var tydelig at det sannsynligviser matriseeffekter som foregår i biomasseprøvene som gjør at ulike komponenter reagerer medhverandre under hydrolysen. Metoden som brukte 6 M HCl ble videre testet på prøver av E. colisom ble dyrket frem med ulike karbonkilder og med ulike vekstrater. Resultatene viste at det eren forskjell i det totalte aminosyre innholdet i prøvene med samme karbonkilde men med ulikevekstrater. I tillegg ble det observert en forskjell i aminosyre sammensetningen mellom prøvenedyrket med forskjellige vekstrater. When doing research, it is important to have accurate references to compare the results to. Today,most research is compared to data from model organisms, or similar organisms to the one studiedif data for the organism in question do not exist.Systems biology is a field that try to make better options for this by making good, computationalmodels, such as Genome Scale Metabolic Models (GEMs), for prediction of for example metabolism.It is crucial to have accurate experimental data to base the GEMs on. The computational modelstry to simulate the entire metabolic system of an organism, and thereby predict the metabolic phenotypes of organisms. It can therefore be used to make biological hypotheses about the organism.The biomass composition of an organism varies with the growth rate, and the organism mightadapt its metabolism to take better advantage of the nutrients available in its environment. Themodel prediction for the so called model organism in certain standard environments are most likelynot representable for similar organisms, or even the same organism under different conditions.Because of this, it would be good to have experimental data to support the GEMs, and in thisproject I focused on improving the method to obtain experimental data of the protein and aminoacid part of the biomass composition.A thorough literature study was carried out, to get knowledge on relevant methods for proteinhydrolysis, and what methods would be able to test at our lab. The focus in the litteraturestudy was on the hydrolysis part which is typically carried out before analysis of amino acids withHigh-Performance Liquid Chromatography (HPLC). We decided to test two different methodsforhydrolysis, one using 6 M hydrochloric acid (HCl) and the other using 4 M methanesulfonic acid(MSA) for 24 hours at 105 ◦C.Both methods were tested on a variety of samples, both pure amino acids and proteins (lysozyme),and biomass samples of Escherichia coli (E. coli) and Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae).We were able to quantify and analyse 17 of the 20 common amino acids. The hydrolysis methodusing 6 M HCl showed overall better recoveries of most amino acids, but it was obvious that theremight be some matrix effects going on in the samples during hydrolysis. The method using HClwas further evaluated on samples of E. coli grown with different carbon sources and at differentgrowth rates. The results showed that there is a difference in the total amino acid content of thedifferent growth rates of the samples grown with the same carbon source. In addition, it showedthat there was a difference in the amino acid composition between the samples grown with differentcarbon sources.