β-(1,3)-glucan-b-chitosan and β-(1,3)-glucan-b-biotin diblocks: Preparation, purification, and characterisation

Abstract

Målet med denne masteroppgaven var å forberede SBG-b-kitosan og SBG-b-biotin diblokker, inkludert fremstilling og rensing av SBG-oligomerer. Polysac- karider kommer fra naturlig rssurser og er ikke-giftige, biokompatible og svært interessante innenfor medisinske applikasjoner. På grunnlag av deres bioaktivitet og immunol- ogiske interaksjoner, er preparering av blokkpolysakkarider av SBG, kitosan og biotin var av stor interesse.

Målet med den første delen av oppgaven var å bryte ned lavmolekylære løselige β-(1,3)-glukaner (SBG) gjennom syrehydrolyse, for å oppnå oligomerer med en grad av polymerisering (DP), dvs. kjedelengde, mellom 1 og 25. En betydelig hindring ved fremstilling av diblokker er den høye konsentrasjonen av salt som følge av ned- brytning og bruk av bufferløsning. I dette studie ble dialyse, en veletablert renseteknikk, sammenlignet med en nylig introdusert sentrifugerings teknikk med brukt av filter i et forsøk på å potensielt redusere rensetiden og øke mengden bevart masse. Resul- tatene viste imidlertid at filteret ikke klarte å bevare SBG-oligomerene og ble ansett som ineffektiv i separering av SBG oligomerer fra de mindre urenhetene.

I den andre delen av masteren ble det fremstilt SBG-b-chitosan diblokker og startet med terminal aktivering av SBG med linkermolekylet O,O’-1,3-propandiylbishydroksylamin (PDHA). En sammenligning ble gjort mellom aktiveringen av en ikke-renset løs-ning av hydrolysert SBG og en renset (dialysert) løsning av hydrolysert SBG, for å bestemme om den høye konsentrasjonen av Na2SO4 i hydrolysatet påvirker reak- sjonskinetikken. Ved å bruke time course 1H-NMR, konkluderes det med at reak- sjonshastigheten mellom de to er neglisjerbar, hvor begge resul0tere i et relativt høyt utbytte på ∼85%. Basert på denne analysen er dermed rensing av SBG-hydrolysat før fremstilling av SBGm -PDHA ikke ansett som nødvendig, noe som reduserer antallet trinn hvor produktet kan gå tapt. Et høyt utbytte på konjugering av SBGm-b-kitosan ble raskt oppnått, med en verdi på > 90% etter bare 30 minutter.

I den siste delen av ble forskjellige SBG-b-biotin-diblokker fremstilt og sammenlignet, for å vurdere overførbarheten av den preparative protokollen mellom SBG- b-biotin diblokker av ulik kjedelengde. Resultatet viste at alle de tre ulike kjedelengdene av SBGm (4 < DP < 20) oppnådde omtrent samme likevektsutbytte på 60%. Ved å øke den molare ekvivalenten fra 2x til 4x mellom SBGm og Biotin-PEG3 økte reaksjonshastigheten, men utbyttet lå fortsatt på det samme. Derfor er yt- terligere forskning nødvendig for å optimalisere den preparative protokollen når det gjelder konjugasjonsutbytte.

The main goal of this master’s thesis was to prepare SBG-b-chitosan and SBG-b- biotin diblocks, including the preparation and purification of SBG oligomers. Polysac- charides come from natural resources and are non-toxic, biocompatible and highly interesting in the field of medical applications. Due to their bioactivity and im- munological interactions, preparing block polysaccharides from SBG, chitosan, and biotin was of great interest.

The objective of the first section of this thesis was to degrade low-molecular soluble β-(1,3)-glucans (SBG) by acid hydrolysis in order to obtain oligomers with a degree of polymerisation (DP), i.e chain length, between 1 and 25. A significant obstacle in the preparation of diblocks is the high concentration of salt resulting from degrada- tion and the utilization of buffer solution. In this study, dialysis, a well-established purification technique, was compared to a recently introduced centrifugal filtra- tion technique in an effort to potentially reduce purification time and increase the amount of mass preserved. However, the results demonstrated that the centrifugal filter failed to preserve the SBG oligomers and was therefore deemed ineffective for separating SBG from minor impurities.

In the second part of the thesis, SBG-b-chitosan diblocks were prepared, starting with terminal activation of SBG with the linker molecule O,O’-1,3-propanediylbishydroxylamine (PDHA). A comparison was made between the activation of a non-purified solution of hydrolysed SBG and a purified (dial- ysed) solution of hydrolysed SBG to determine if the high concentration of Na2SO4 in the hydrolysate affects reaction kinetics. Using time-course 1H-NMR, the reac- tion rate between the two is concluded to be neglected, both resulting in a relatively high yield of ∼ 85%. Thus, purification of SBG hydrolysate prior to preparation of SBGm-PDHA is, based on this analysis is not necessary, reducing the number of steps in which product can be lost. Following, conjugation of SBGm-b-chitosan was quickly obtained, with a yield of > 90% after only 30 minutes.

In the final part of this thesis, different SBG-b-biotin diblocks were prepared and compared to assess the transferability of the preparative protocol between SBG-b-biotin diblocks of different chain lengths. The result showed that all tree chain lengths of SBGm (4 < DP < 20) obtained approximately the same combined equi- librium yield of 60%. By increasing the molar equivalent from 2x to 4x between SBGm and Biotin-PEG3 the reaction rate increased, but the combined yield was un- changed. Therefore, additional research is necessary to optimize the preparative protocol in terms of conjugation yield.