Degumming of Ballan wrasse (Labrus bergylta) eggs

Abstract

Etterspørselen etter berggylt (Labrus bergylta) har økt gjennom årene på grunn av dens effektivitet som rensefisk for å fjerne lakselus (Lepeophtheirus salmonis) fra oppdrettslaks (Salmo salar) i merder. En av utfordringene i kommersielle klekkerier er å jobbe med bentiskeklebende egg. Dagens metoder resulterer i lav overlevelse og høy dødelighet for eggene på grunn av utfordringene med smuss som klamrer seg fast, ineffektiv desinfeksjon, biologisk sikkerhet, anoksi og mer. Noen få forsøk ble utført for å eliminere klebrigheten til berggylt-eggene ved bruk av garvesyre, natriumsulfitt, L-cystein, leiresuspensjon, melk, og enzymalkalase med og uten ringers løsning, hvorav kun var effektiv. Denne studien var den første i sitt slag som testet flere potensielle proteaseenzymer som effektivt kunne løsne de klebrige bergylteggene. Seks behandlinger ble testet: enzym alkalase (2%), trypsin (2000, 200, 40, 20 U/ml), proteinase K (900, 700, 400 µAnsonU/ml), ananasjuice (16, 8, 4, 1%), papain fra Carica papaya (2, 4 %), papain fra papaya lateks (50, 10, 5 U/ml) in vitro. Egg ble mottatt mens de var festet til gytematter fra MOWI påfølgende befruktningsdag. Et mattefragment på 2,5 x 5 cm som inneholdt egg ble festet til en flokkulatorarm dyppet i den enzymatiske løsningen og rørt om ved 50 rpm. De eggene som løsnet fra mattene ble ansett som ikke-klebrige, og kategoriserte de falne eggene i fire trinn. (a) avgummet, (b) svellet, (c) delvis avgummet eller (d) ikke avgummet. Studien ble delt inn i to faser; 1. fase var en screeningsfase, som satte søkelys på optimalisering av enzymarbeidsforhold ved å endre parametere som pH, tid og EDTA-tilsetning. Den andre fasen var hoved-eksperimentet, som fokuserte på å påføre proteaser ved optimaliserte forhold i en varighet på 30 minutter. I samsvar med de tidligere studiene frigjorde alkalase 68 ± 8,2 % av eggene fra mattene mens de plasserte 58,6 ± 10,9% av eggene i avgummet kategori. Foruten alkalase var papain fra Papaya-latex den eneste effektive behandlingen som frigjorde henholdsvis 88 ± 5,7%, 78 ± 9,9% og 84 ± 6,6% av eggene fra matten ved konsentrasjoner på 50, 10, 5 U/ml. Videre avslørte gummilagsklassifiseringen at papain (50, 5 U/ml) hadde avgummet ˃80% av de fallne eggene mens de nådde ˃90% for papain 10 U/ml-behandlingen. Klekkehastigheten viste ingen signifikante forskjeller mellom de enzymatiske behandlingene. Imidlertid hadde papainbehandlingene (50, 10, 5 U/ml) lav klekkehastighet på henholdsvis 55 ± 6,5%, 58 ± 19,7% og 62 ± 14,9% sammenlignet med kontroll (sjøvann) 77 ± 5,6 % og alkalase 67 ± 4,7 %. Morfologiske målinger av nyklekkede larver viste ingen signifikant forskjell mellom behandlingene, bortsett fra alkalasebehandlinger som viste signifikant lavere myotom høyde og større øye-til-kropp-forhold sammenlignet med kontrollene. Spinaldeformiteter inkludert halebøyninger, brudd og buet ryggrad viste ingen signifikant forskjell mellom behandlingene. Plommesekk/perikardieødem ble vurdert fra 0 til 2 avhengig av alvorlighetsgrad, hvor den milde ødemdeformiteten var til stede i alle behandlingene, ˃50 % i papainbehandlingene med en signifikant forskjell. Alcalase var den eneste behandlingen som forårsaket brudd-deformiteten ˃22%. Bruken av papain fra papaya lateks har vist seg å være effektiv for å løsne eggene fra underlaget uten noen signifikant effekt på klekkehastigheten, men med forekomst av mild ødemdeformitet. Imidlertid er disse avgumming-protokollene in situ, og oppnåelse av avgumming av berggylt-egg i kommersiell skala må fortsatt standardiseres.

The demand for Ballan wrasse (Labrus bergylta) has increased over the years due to its proven efficiency as a cleaner fish to remove sea lice (Lepeophtheirus salmonis) from farmed salmon (Salmo salar) in sea cages. One of the hurdles in commercial hatcheries is working with benthic adhesive eggs. The current techniques result in low survival and high mortality of the incubated eggs due to the challenges with dirt clinging, ineffective disinfection, biosecurity risk, anoxia and more. A few attempts were carried out to eliminate the stickiness of the Ballan wrasse eggs using tannic acid, sodium sulfite, L-cysteine, clay suspension, milk, and enzyme alcalase with and without ringer solution, out of which only enzyme alcalase was found effective. This study was the first of its kind to test more potential protease enzymes that could effectively degum Ballan wrasse eggs. Six treatments were tested: enzyme alcalase (2%), trypsin (2000, 200, 40, 20 U/ml), proteinase K (900, 700, 400 µAnsonU/ml), pineapple juice (16, 8, 4, 1%), papain from Carica papaya (2, 4%), papain from papaya latex (50, 10, 5 U/ml) in vitro. Eggs were received while attached to spawning mats from MOWI on the following day of fertilization. A mat fragment of 2.5x5cm containing eggs was attached to a flocculator arm dipped into the enzymatic solution and agitated at 50rpm. The detached eggs from the mats were considered non-sticky, categorising the fallen eggs in four stages. (a) degummed, (b) swelled, (c) partly degummed or (d) not degummed. The study was divided into two phases; 1st phase was a screening phase, which focused on the optimization of enzyme working conditions by changing parameters such as pH, time and EDTA addition. The 2nd phase was the main experiment, which focused on applying proteases at optimized conditions for a 30min duration. Consistent with the previous studies, alcalase liberated 68 ± 8.2% of the eggs from the mats while placing 58.6 ± 10.9 % of eggs in the degummed stage. Besides alcalase, papain from papaya latex was the only effective treatment that liberated 88 ± 5.7%, 78 ± 9.9% and 84 ± 6.6% of eggs from the mat at 50, 10, 5 U/ml concentrations, respectively. Further, gum layer classification revealed that papain (50, 5 U/ml) had degummed ˃80% of the fallen eggs while reaching ˃90% for the papain 10 U/ml treatment. The hatching rate revealed no significant differences among the enzymatic treatments. However, the papain treatments (50, 10, 5 U/ml) had low hatch rate 55 ± 6.5%, 58 ± 19.7% and 62 ± 14.9% respectively, when compared to control (seawater) 77 ± 5.6% and alcalase 67 ± 4.7%. Morphological measurements of newly hatched larvae showed no significant difference among the treatments, except for alcalase treatments that displayed significant lower myotome height and larger eye-to-body ratio compared to controls. Spinal deformities including tail flexures, breaks and curved spine showed no significant difference among the treatments. Yolk sac/pericardial edema was rated from 0 to 2 depending on severity, where the mild edema deformity was present in all the treatments, ˃50% in the papain treatments with a significant difference. Alcalase was the only treatment that caused the break deformity ˃22%. The use of papain from papaya latex has proven to be effective in detaching the eggs from the substrate with no effects significant effects on hatching rate but with the occurrence of mild edema deformity. However, these degumming protocols are in situ, and achieving degumming of the Ballan wrasse eggs at a commercial scale still needs to be standardized.