Development of Molecular Tools in the Diatom Coscinodiscus wailesii

Abstract

Þróun Sameindalíffræði tooes í kísilþörungar Coscinodiscus Wailesii kísilþörungars eru þekktir fyrir fjölmörg form og eyðublöð sem gefin eru af frumuveggnum sínum úr kísil sem heitir frustule. Þeir eru einnig mjög mismunandi í stærð. Rannsóknir á erfðafræðilegum erfðafræðilegum köflum hefur aðallega lagt áherslu á litla kísil af hagnýtum ástæðum, svo sem genamengi, en einnig þægindi af styttri kynslóð minni smærri frumna.

Þrátt fyrir að hafa lengri tvöföldunartíma, sinna stórum köflum tiltölulega hvað varðar lífmassaþéttleika og vöxt, sem gerir þeim góðan frambjóðandi tegundir til framleiðslu á iðnaðar mælikvarða. Þessir kostir gætu gert risastórt dísir góðar frambjóðandi tegundir til að mæla upp framleiðslu. Nauðsynlegt er að þróa aðferðir og þekkingu á risastórt kísilgen tjáningu til að gefa lausan tauminn iðnaðar möguleika sína í náinni framtíð. Þessi aðalritgerð sem miðar að því að beita erfðafræðilegum verkfræði í C. wailesii með samskiptum í E. coli.

Þar sem tilraunir til að starfrækja samtengingar í Coscinodiscacae eru hingað til unreported, þurfti að hanna ræktun og valferli. Enn fremur, vegna vanhæfni til að vaxa C. wailesii á þýðingar, var nýtt í þýðingar rækun samskiptareglur þróað. Frá birtu erfðamengjafræði röð C. wailesii, mjög gefið upp verkefnisstjórar frá gen CwLHCF4-like og CwLHCFNew-1 voru notuð til að hanna episomes. Plasmíðin fyrir samtengingu samanstanda af pCwPUC3Mut burðarás í tengslum við verkefnisstjóra, terminator og sértækur merkisgen. Vandlátur genið er sett í plasmíðið, almennt ble (zeocin). Fyrri tilraunir sýndu að C. wailesii getur ekki þolað styrkleika 50 g / ml af zeocin.

Frá og með í dag var ekki hægt að sýna samskipt DNA flytja milli baktería og C. wailesii. Skjalið miðar að því að veita skýringarmynd um hvernig á að þróa sameindaverkfæri í kísilum og hvetja aðra rannsóknaraðila til að taka við verkefninu með því að nota upplýsingarnar sem uppgötvast á aðalritgerðinn

Diatoms are known for their numerous shapes and forms given by their cell wall made of silica named frustule. They also differ significantly in size. The research on diatom genetics has mainly focused on small diatoms for practical reasons, such as genome size, but also the convenience of shorter generation time of smaller cells. Despite having a longer doubling time, big diatoms perform comparatively in terms of biomass density and growth, making them good candidate species for industrial scale production. Those advantages could make the giant diatoms good candidate species to scale-up production. It is necessary to develop methods and knowledge on the giant diatom gene expression to unleash their industrial potential in the near future. This master thesis aimed to apply genetic engineering in Coscinodiscus wailesii by trans-kingdom conjugation from Escherichia coli.

As attempts to operate conjugations in Coscinodiscacae are hitherto unreported, cultivation and selection processes had to be designed. Furthermore, due to the inability to grow C. wailesii on agar, a new in-agar culture protocol was developed.

From the published genomic sequence of C. wailesii, highly expressed promoters from the gene CwLHCF4-like and CwLHCFNew-1 were used to design the episomes. The plasmids for conjugation are composed of a pPtPUC3Mut backbone associated with the promoters, a terminator and a selective marker gene. The selective gene inserted in the plasmid, the commonly use ble (zeocin). Previous experiments shown that Coscinodiscus wailesii cannot tolerate a concentration of 50 μg/mL of zeocin.

As of today, the conjugative DNA transfer between bacteria and C. wailesii could not being demonstrated. The document aims to provide an explanatory protocol on how to develop molecular tools in diatoms and encourage other researcher to take over the project using the information discovered during the master thesis.