Functional Characterisation of Alginate Modifying Enzymes - Enzyme Kinetics of mannuronan C-5 epimerase AlgE4 and Profile of Alginate Lyases PsPL7A-C

Abstract

Tang anses som en bærekraftig ressurs for fornybar biomasse. Alginat er et av de viktigste polysakkaridene som finnes i celleveggen til brunalger og i den eksocellulære matrisen til noen bakterier. Alginat har et bredt anvendelsesområde siden det fungerer som gelerings- og fortykningsmidler i alt fra matingredienser til applikasjoner i biomedisinske sektorer. Alginater består av 1-->4 koblede enheter av β-D-mannuronsyre (M) og C5 epimer α-L-guluronsyre (G). Rekkefølgen av enheter varierer og dette skaper blokkmønstre som hovedsakelig bestemmer egenskapene til alginatet.

Alginatmodifiserende enzymer endrer strukturen i polysakkaridkjeden, og de to hovedtypene er mannuronan C-5 epimeraser og alginatlyaser. Slike enzymer kan brukes til å lage skreddersydd alginat. For å gjøre dette er det viktig å forstå hvordan alginatmodifiserende enzymer fungerer. I dette arbeidet studeres to aspekter ved enzymer: kinetikk og proteinstruktur. AlgE4 er en av syv ekso-cellulære mannuronan C-5 epimeraser som tilhører bakterien Azotobacter vinelandii. Enzymet introduserer en vekslende struktur (MG-blokk) på mannuronansubstrat. AlgE4 mistenkes for å være et prosessivt enzym som utsettes for produkt inhibering. Imidlertid er det ikke funnet en kinetisk modell som beskriver produkt inhiberingen. I denne oppgaven er kinetikken til AlgE4 blitt studert med eksperimentell data fra forsøk med metning av substrat og 13C-NMR-spektroskopi, og videre undersøkt med invers Michaelis-Menten kinetikk og modeller som inkluderer produkt inhibering. Tre alginatlyaser fra den marine soppen Paradendryphiella salina ble nylig oppdaget. Å produsere proteinene i Escherichia coli er et første skritt mot å produsere isotopmerkede proteiner for påfølgende strukturell karakterisering med NMR-spektroskopi.

Den initielle raten av AlgE4-aktivitet ble funnet med en førsteordens modell og hadde en hyperbolsk form som den inverse Michaelis-Menten-ligningen kunne modeleres for. Likningen hadde imidlertid dårlig passform. De tidsoppløste 13C-NMR-spektrene viste at G-blokk produksjon hadde skjedd i løpet av reaksjonen. Dette vil sannsynligvis påvirke aktiviteten til AlgE4 og kan indikere at platået som observeres for initial hastighet kanskje ikke skyldes metning av substrat. Den molare konsentrasjonen av "angrepssteder" for epimerisering med AlgE4 ble funnet. På grunn av G-blokkdannelse er det imidlertid tvilsomt hvordan en slik parameter kan beskrive aktiviteten til AlgE4, da dette vil introdusere nye mulige angrepssteder. En kinetisk modell som inkluderte produkt inhibering kunne tilpasses de eksperimentelle dataene, og bekrefter antagelsen om at produkt inhibering påvirker epimeriseringsraten.

P. salina alginatlyaser PsPL7A-C ble produsert i E. coli, men proteinene aggregerte i uløselige inkluderingslegemer. Dette er et vanlig problem å støte på når man uttrykker heterologt eukaryotisk protein i E. coli. I dette tilfellet er det sannsynligvis forårsaket av for omfattende proteinsyntese eller mangel på nødvendig PTM-maskineri for riktig proteinfolding. ettersom produksjon i E. coli viste seg å være komplisert, er produksjon med Pichia Pastoris et alternativ til å produsere isotopmerkede proteiner for strukturell karakterisering.

Seaweeds are regarded as sustainable resources of renewable biomass. Alginate is one of the main polysaccharides found in the cell wall of brown algae and in the exocellular matrix of some bacteria. It has a broad area of application due to alginates function as gelation and thickening agents, ranging from food ingredients to the biomedical sectors. Alginates consists of 1-->4 linked residues of β-D-mannuronic acid (M) and its C5 epimer α-L- guluronic acid (G). The residue sequences vary and create block patterns which mainly determine the properties of the alginate.

Alginate modifying enzymes alter the structure of the polysaccharide chain and the two main types are mannuronan C-5 epimerases and alginate lyases. Such enzymes can be used to create tailor-made alginate. To do so it is essential to understand how alginate modifying enzymes function. In this work two aspects of enzyme function is studied: reaction kinetics and protein structure. AlgE4 is one of seven exo-cellular mannuronan C-5 epimerases belonging to the bacteria Azotobacter vinelandii. The enzyme introduce an alternating structure (MG-block) on mannuronan substrate. AlgE4 is suspected to be a processive enzyme subjected to product inhibition. However, a kinetic model describing product inhibition has not been determined. In this thesis have the kinetics of AlgE4 been obtained from substrate saturation experiments with 13C-NMR spectroscopy and investigated with inverse Michaelis-Menten kinetics and models including product inhibition. Three alginate endo-lyases from the marine fungi Paradendryphiella salina were recently discovered. Expressing the proteins with an Escherichia coli expression system is a first step toward producing isotope-labelled proteins for subsequent structural characterisation with NMR spectroscopy.

The initial rate of AlgE4 activity found using a first-order model provided a hyperbolic shape which the inverse Michaelis-Menten equation could be fitted to. However, the equation had a poor fit. The time-resolved 13C-NMR spectra showed that G-block production had occurred. This is likely to affect the activity of AlgE4 and could indicate that the plateau observed for initial rate might not be due to substrate saturation. The molar concentration of attack-sites for epimerisation by AlgE4 was derived. However, due to G-block formation it is questionable how such a parameter can describe the activity of AlgE4 as this would introduce new possible attack-sites. A kinetic model including product inhibition was found to fit the experimental data, and in so affirming the assumption of product inhibition affecting the rate of epimerisation.

P. salina alginate lyases PsPL7A-C were successfully expressed in E. coli, but the proteins aggregated into insoluble inclusion bodies. This is a common problem to encounter when expressing heterologous eukaryotic protein in E. coli expression systems. In this case it is likely caused by too extensive protein synthesis or lack of required PTM machinery for proper protein folding. As expression with E. coli proved to be complicated is expression in a Pichia Pastoris system an alternative to attain isotope-labelled proteins for structural characterisation.