Investigating the Role of Stress Responses in Escherichia coli in Persister Formation through Persister Quantification of relA and rpoS null mutants

Abstract

Bakterier som overlever behandling med antimikrobielle stoffer, er et økende, globalt problem og er estimert å kunne bli årsaken til 10 millioner dødsfall innen 2050 om dagens trend, med høy bruk og lav utvikling av antibiotika, fortsetter. Persistente bakterier, definert som en subpopulasjon som overlever høye doser av antibiotika, øker utviklingen av resistens og er samtidig vist å være involvert i tilbakevendende infeksjoner. Likevel har persistere fått lite fokus og mekanismene bak persisterdannelse er fortsatt i stor grad ukjent. Flere mekanismer er foreslått, og involverer stressresponser slik som stringentresponsen og den generelle stressresponsen. Å forstå mekanismen bak persisterutviklingen er nyttig for bekjempelse av den økende resistenskrisen.

I denne oppgaven ble rollen til RelA og RpoS, proteiner involvert i henholdsvis stringent- og den generelle stressresponsen, undersøkt i Escherichia coli K12 MG1655 ved å sammenligne relA og rpoS nullmutanter med villtypen i ulike fysiologiske forhold. Vi har målt overlevelse etter fem timer behandling med ulike klasser av antibiotika i ulike vekstfaser og vekstmedia. Resultatene indikerer at RelA og RpoS bidrar til økt persisterformasjon i noen fysiologiske forhold. RpoS øker overlevelsen i karbonbegrensende forhold og RelA øker overlevelsen i både karbon- og nitrogenbegrensende forhold, men kun ved bruk av enkelte typer antibiotika. Massespektrometriske metoder til måling av metabolitter avdekket at sub-letale doser av ciprofloxacin økte konsentrasjonen av metabolitter involvert i den sentrale karbonmetabolismen. Denne oppgaven viser at det er et behov for standardiserte protokoller i persisterfeltet fordi eksperimentoppsettet påvirker resultatene, og videre at mekanismene for persisterformasjon er ulike ut ifra hva slags forhold bakteriene lever i. Det bør i videre forskning legges vekt på kontrollerte inkubasjonsforhold slik at interlaboratoriske forskjeller ekskluderes i størst mulig grad.

Survival of bacteria treated with antimicrobial agents is an emerging problem and is estimated to be the cause of 10 million annual deaths by 2050 if today’s trend, wherein the use of antibiotics is high and the development of new ones are low, continue. Persistent bacteria, a subpopulation of bacteria that survives high doses of antibiotics, increase the development of resistance and are present in recurrent infections hard to treat. Despite this, persisters have gained little focus and mechanisms of persister formation are still unclear. Several mechanisms are proposed, including the stress responses in the cell, such as the stringent and general stress response. Understanding the mechanisms leading to persistence will be valuable in combating the global problem of survival of bacteria exposed to antibiotics.

This thesis explores the role in persister formation of RelA and RpoS, proteins in the stringent and general stress response, respectively, in Escherichia coli K12 MG1655 by comparing relA and rpoS null mutants to the wild type in different physiological conditions with different classes of antibiotics. By measuring survival after five hours of treatment, our results indicate that RelA and RpoS contribute to increased persister formation, but only in certain conditions. The results show that RpoS led to increased survival in carbon limited conditions, and that RelA led to increased survival in both carbon and nitrogen limited conditions, but that these results were dependent on the class of antibiotic used. Mass spectrometry-based metabolomics showed that sub-lethal concentrations of ciprofloxacin led to increased concentrations of metabolites involved in the central carbon metabolism. Our results show that highly standardized protocols in the field of persistence are needed as experimental setup seems to influence persister formation. This could decrease interlaboratory differences in future research in the field of persistence.