Janthinobacterium Strains Isolated from Rearing Systems for Atlantic Salmon Fry Growth Characteristics, Violacein Production and Evolution of the Violacein Operon
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/2782671Utgivelsesdato
2021Metadata
Vis full innførselSamlinger
Sammendrag
Janthinobacterium lividum er tidligere isolert fra amfibieskinn og menneskehud. Arten er kjent for åprodusere det lilla pigmentet violacein, som har vist seg å ha antifungale, antibakterielle, antiviraleog antitumorale egenskaper. Dette brede spekteret av biologiske egenskaper har gjort J. lividumtil en lovende kandidat i medisinske applikasjoner som antibiotika og som behandling mot kreft.Grunnet J. lividums kjente antifungale egenskaper kan den være en interessant probiotisk kandidatmot saprolegniose forårsaket av sopp-patogenet Saprolegnia. Sykdommen kan føre til død blantoppdrettslaks og følgelig store økonomiske tap i havbruksnæringen. Dagens behandlingsmetoderinvolverer bruk av skadelige kjemikalier og er sterkt omdiskutert. Det er derfor et økende behov fornye bærekraftige alternativer. Foreløpig er mekanismene forbundet med violaceinproduksjon og J.lividums rolle som en kommensal for atlanterhavslaks enda ikke helt forstått.
I dette masterprosjektet ble de fem Janthinobacterium-stammene PBA, PBB, MM5, 3.109 og 3.116,tidligere isolert fra oppdrettssystemer for yngel av atlanterhavslaks, studert nærmere. Dette prosjektet hadde som mål å sekvensere violaceinoperonet til PBA, PBB og MM5 og deretter gjennomførefylogenetiske analyser for å studere evolusjonen av violaceinoperonet. Veksteksperimenter ble utførtfor å gi en ytterligere forståelse av stammenes vekstegenskaper, deres potensielle violaceinproduksjonog antagonistiske egenskaper, samt deres evne til å kolonisere skinnet og tarmen til plommesekkyngelav atlanterhavslaks. Sekvenseringen av violaceinoperonene var vellykket og viste at PBA og PBBhadde alle fem violaceinoperon-genene, VioA-VioE. Videre analyse av aminosyresekvensene antydetat MM5 ikke hadde et funksjonelt VioE-genprodukt, og at den siste halvdelen av VioB-genet (3’enden) for både PBA og MM5 var trunkert. De fylogenetiske analysene indikerte at violaceinoperonethar gjennomgått horisontal genoverføring i evolusjonen av Proteobacteria. Måling av maksimalabsorbans for etanolekstrakt av violacein fra PBA, PBB og J. lividum resulterte i bølgelengder på 576nm, 574 nm og 575 nm, noe som tydelig indikerte at violacein var tilstede. Videre viste alle stammeneindikasjoner på å vokse i celleaggregater og produserte store mengder slim i flytende LB-medium.Alle stammene viste både glatt og rynkete kolonimorfologi da de ble dyrket på LA-plater, bortsettfra 3.116 som hele tiden vokste med glatt overflate. Alle stammene var i stand til å vokse med mucinog kitin som eneste karbonkilde, noe som underbygget deres mucin- og kitin-degraderende evner.Undersøkelse av stammenes antagonistiske egenskaper viste indikasjoner på inhibering av Pedobacter,men ingen inhibering av Yersinia ruckeri eller Arthrobacter. Fravær av violaceinproduksjon såikke ut til å påvirke den potensielle antagonistiske aktiviteten til Janthinobacterium-stammene motPedobacter. Alle stammene koloniserte skinnet til plommesekkyngel av atlanterhavslaks med ethøyt antall bakterier. Videre ble det vist at koloniseringstettheten i tarmen generelt var lavere ennpå skinnet for alle stammene. De to stammene PBA og 3.109 manglet tilsynelatende evnen til åkolonisere tarmen til lakseyngel, samt evnen til å vokse planktonisk i fiskevannet. Studiet viste atJanthinobacterium kan være en kommensal bakterie i skinnet til atlanterhavslaks. Janthinobacterium lividum is commonly isolated from the skin of amphibians and humans. Thespecies is known for producing the purple pigment violacein, exhibiting antifungal, antibacterial,antiviral and antitumoral effects. This wide range of biological activities have made J. lividum apromising candidate in medical applications as an antibiotic and as a treatment for cancer. Due toits well known antifungal properties, J. lividum might be an interesting probiotic candidate againstsaprolegniosis, caused by the fungal pathogen Saprolegnia. The disease can lead to the death offarmed Atlantic salmon and hence severe economic losses in the aquaculture industry. Today’streatment approaches involve the use of harmful chemicals and are highly debated. Thus, there is agrowing need for new sustainable alternatives. However, the mechanisms driving the production ofviolacein and J. lividum’s role as a commensal of Atlantic salmon are not yet fully understood.
In this master project, the five J. sp. strains PBA, PBB, MM5, 3.109 and 3.116, previously isolatedfrom rearing systems for Atlantic salmon fry, were studied more closely. This study aimed tosequence the violacein operon of J. sp. PBA, PBB and MM5 and conduct phylogenetic analyses tostudy the evolution of the violacein operon. Growth experiments were performed to provide furtherunderstanding of the J. sp. strains’ growth characteristics, their potential violacein production andantagonistic properties, as well as their ability to colonize the skin and gut of Atlantic salmon yolksac fry. The sequencing of the violacein operons was successful, providing evidence that J. sp. PBAand PBB possessed all five violacein operon genes, VioA-VioE. However, analysis of the amino acidsequences suggested that J. sp. MM5 did not have a functional VioE gene product, and that thelast half of the VioB gene (3’ end) for both J. sp. PBA and MM5 was truncated. The phylogeneticanalyses indicated that the violacein operon had been subjected to horizontal gene transfer duringthe evolution of the Proteobacteria. Measuring the maximum absorbance of ethanol extracts ofviolacein from J. sp. PBA, J. sp. PBB and the J. lividum type strain, resulted in wavelengths of576 nm, 574 nm and 575 nm, strongly suggesting the presence of violacein. Moreover, all J. sp.strains showed indications of growing in cell aggregates and produced copious amounts of slime whencultivated in liquid LB-medium. All strains exhibited both smooth and rugose colony morphologywhen grown on LA-plates, except for J. sp. 3.116, which surface was consistently smooth. Further,the strains were able to grow with mucin and chitin as their sole carbon source, substantiating theirmucin and chitin-degrading abilities. Examination of the J. sp. strains’ antagonistic activity, showedindications of inhibition against Pedobacter sp., but not against Yersinia ruckeri or Arthrobacter sp.Absence of violacein production did not seem to affect the potential antagonistic properties of theJ. sp. strains against Pedobacter sp. Further, all strains were able to colonize the skin of Atlanticsalmon yolk sac fry in high numbers. For all J. sp. strains, the colonization density of the gut wasgenerally lower than on the skin. The two J. sp. strains PBA and 3.109 seemingly lacked the abilityto colonize the gut of salmon fry, as well as growing planktonically in the rearing water. Overall,the study support that Janthinobacterium might be a commensal of Atlantic salmon skin.