Påvirker 5-metylcytosin i det humane genom fjerning av uracil?
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/2775932Utgivelsesdato
2020Metadata
Vis full innførselSamlinger
Beskrivelse
Full text not available
Sammendrag
UNG2 (uracil DNA-glykosylase) er det dominerende enzymet som fjerner uracil i det humanegenomet. Metylert cytosin (5-metylcytosin (5-mC)) utgjør omtrent 1% av det humane DNA,og er med det den vanligste epigenetiske modifikasjonen. Formålet med studien var åundersøke om 5-mC påvirker UNG2-mediert gjenkjenning og fjerning av uracil i ulikeposisjoner i forhold til metyleringen. Forsøkene ble gjennomført på DNA-oligonukleotidermed eller uten 5-mC i tillegg til uracil. 5-mC og uracil ble også lokalisert med definerteavstander i forhold til hverandre i samme eller i hver sin DNA tråd. Oligonukleotidene ble såsubstrat for renset, rekombinant UNG2. Under enzymatisk utkutting av uracil ble det dannetapyrimidine (AP-seter) hvor det ble indusert trådbrudd ved eksponering mot piperidin.Substrat- og produkt-fragmenter ble separert etter størrelse ved hjelp av polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) og kvantifisert ved hjelp av ImageQuant. Vi fant at 5-mC to seteroppstrøms og nedstrøms for uracil påvirket aktiviteten til UNG2 på ssDNA, men effekten varioneavhengig. 5-mC et sete nedstrøms for uracil virket inhiberende på aktiviteten til UNG2 på dsDNA via indirekte påvirkning på sekundærstrukturen. Metylering i motsatt tråd haddeingen innvirkning på aktiviteten til UNG2. Påvirkningen av metyleringen varierte avhengig avsaltinnhold i løsningsbufferen. UNG2 (uracil DNA glycosylase) is the dominant enzyme that removes uracil in the humangenome. Methylated cytosine (5-methylcytosine (5-mC)) makes up about 1% of human DNA,and is thus the most common epigenetic modification. The purpose of the study was toinvestigate whether 5-mC affects UNG2-mediated detection and removal of uracil in differentpositions relative to the methylation. The experiments were performed on DNA oligonucleotides with or without 5-mC in addition to uracil. 5-mC and uracil were also localized with defined distances relative to each other in the same or in separate DNA strands. The oligonucleotides were then substrate for recombinant UNG2. During enzymatic excision of uracil apyrimidine sites (AP sites) were formed, and strand breakage was induced upon exposure to piperidine. Substrate and product fragments were separated by size by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and quantified by ImageQuant. We found that 5-mC two seats upstream and downstream of uracil affected the activity of UNG2 on ssDNA, but the effect was dependent of the ion concentration. 5-mC one seat downstream of uracil inhibited the activity of UNG2 on dsDNA via indirect influence on the secondary structure. Methylation in the opposite strand had no impact on the activity of UNG2. The effect of the methylation varied depending on salinity in the solution buffer.