Hypoxic-ischemic brain injury: Melatonin treatment with lipid-based nanoparticles

Abstract

Lave nivå av oksygen og begrenset blodforsyning rundt fødsel, også kjent som perinatal hypoksisk iskemi (HI), kan forårsake hjerneskade gjennom en progressiv kaskade (1). HIindusert hjerneskade er en av de viktigste årsakene til neonatal dødelighet, og er assosiert med økt risiko for nevrologiske utviklingsforstyrrelser, som cerebral parese. Tilstanden er derfor et alvorlig helseproblem. Behandlingen består i dag av støttende behandling og terapeutisk hypotermi som startes innen seks timer etter at skaden har inntruffet. Behandlingen har imidlertid bare delvis effekt, og nesten 50% av nyfødte som får behandlingen har bivirkninger (4). Det er derfor behov for ny effektiv, trygg og enkel nevroprotektiv behandling for denne pasientgruppen. Melatonin, et nevrohormon utskilt hovedsakelig fra epifysen, er et mulig nevroprotektivt legemiddel mot HI-indusert hjerneskade, antageligvis på grunn av dets antioksidative egenskaper (5). Flere studier blant dyr har vist at melatonin forhindrer død av nevroner og astroglia celler etter HI-indusert hjerneskade i den nyfødtperioden (6). Disse funnene understøtter melatonins potensielle rolle i forebygging av HI-indusert hjerneskade hos nyfødte mennesker. Selv om melatonin kan gis peroralt til mennesker, så har middelet lav biotilgjengelighet på grunn av høy førstepassasjemetabolisme (7). Melatonin er også lite løselig i vann, lyssensitivt, og ustabilt når det er oppløst (8). Dette har i dyrestudier blitt omgått gjennom bruk av organiske løsemidler, som DMSO eller etanol, for å lage formuleringer som kan injiseres. Slike løsemidler kan imidlertid ha nevrotoksiske virkninger, som nyfødte er særlig sårbare for (9). Det overordnede målet ved denne avhandlingen var å utvikle en melatoninformulering uten organiske løsemidler, og undersøke dets effekt på HI-indusert hjerneskade. På grunn av melatonins fettløselighet så er lipidbaserte nanopartikler, som liposomer og nanoemulsjoner, lovende løsemidler. I dette arbeidet har vi utviklet og karakterisert melatonin løst i liposomer og nanoemulsjoner, og vist at melatonin løst i liposom er bedre enn melatonin løst i nanoemulsjoner eller organiske løsemidler. Vi gjennomførte en farmakokinetisk studie, som viste at når 10 mg/kg melatonin som ble løst i liposomer, nanoemulsjoner og DMSO-formulering og deretter gitt til voksne rotter, så hadde melatonin fra lipidbaserte nanopartikler høyere konsentrasjon i hjernen enn melatonin fra DMSO, og alle tre formuleringene viste lignende konsentrasjon i blodet. Den beste nanoformuleringen ble så brukt i en behandlingsstudie med nyfødte rotter. Vi undersøkte effekten av liposomløst melatonin gitt intraperitonealt i en etablert dyremodell for HI-hjerneskade, og sammenlignet med melatonin løst i DMSO. Studien indikerte at liposomalt melatonin har en moderat nevroprotektiv effekt. Vi fant imidlertid redusert vektøkning hos melatoninbehandlede dyr, som kan ha blitt forårsaket av redusert matinntak på grunn av melatonins søvninduserende effekt. Redusert vektøkning kan også maskere virkningen av medisinen, da redusert vektøkning også er assosiert med mer alvorlig hjerneskade. Etter justering av resultatene for vektøkning var liposomalt melatonin bedre enn både melatonin løst i DMSO, og kontrollgruppen. Det ble imidlertid observert stor variasjon i alle behandlingsgruppene som gjorde det vanskelig å finne forskjeller i effekt. Det var derfor behov for en mer kontrollert og reproduserbar modell for HI-hjerneskade, for å kunne studere melatonins effekt isolert fra andre faktorer. I den tredje studien utviklet vi derfor et et nukleær-magnetisk resonans (NMR)-kompatibelt perfusjonssystem for å utføre oksygenglukose deprivasjon (OGD) på hjernevev ex vivo, kalt en bioreaktor. Vi optimaliserte og brukte bioreaktoren for å studere snitt fra voksne rotter, og studerte metabolske endringer i vevet i sanntid. Resultatene viste klare forskjeller i metabolsk respons mellom 30, 60 og 120 minutters OGD, sammenlignet med kontroll. 31P NMR-spekter av kontrollprøvene viste at nivåene av PCr/Pi var stabile over fem timer i bioreaktoreksperimentet. 1H NMR spectra viste at nivåene av Lac/NAA var stabile, med en tendens til gradvis økning på grunn av resirkulasjon av aCSF i perfusjonssystemet. Dette oppsettet resulterte i tilfredsstillende spekterkvalitet for både 1H og 31P, og muliggjorde observasjon av metabolske forandringer før, under og etter OGD. Systemet gav også høy reproduserbarhet og kontroll over miljøet. Dette gjør dette bioreaktoren til et velegnet modellsystem for å undersøke effekten av melatonin og andre lovende legemidler etter HI-hjerneskade. Denne forskningen har vist at det er mulig å utvikle ikke-toksiske parenterale formuleringer av melatonin ved bruk av liposomer. Behandlingsstudien på nyfødte rotter har vist at det er behov for ytterligere doseoptimalisering. I tillegg har vi etablert en reproduserbar og kontrollert ex vivo-modell for sanntidsmålinger av energimetabolisme under og etter HIhjerneskade. Denne modellen kan brukes i fremtidige studier for å studere effekten av intervensjoner, som melatonin, og melatonin understøttet av hypotermi, på metabolsk respons og mitokondriell funksjon.

Inadequate levels of oxygen and restriction of blood supply around birth, known as perinatal hypoxia-ischemia (HI) may lead to brain injury through a progressive injury cascade. HI brain injury is one of the main causes of neonatal mortality and is also associated with an increased risk of neurodevelopmental disabilities, such as cerebral palsy. The standard treatment of these infants consists of supportive care and therapeutic hypothermia started within six hours after the event. However, the cooling treatment is only partially effective with almost 50% of treated newborns having side effects. Hence, there is an urgent need to develop more efficient, safe, and simple neuroprotective treatment. Melatonin, a neurohormone secreted primarily from the pineal gland, is a potential neuroprotective agent after a neonatal HI event, presumably due to its antioxidative properties. Many rodent and large animal studies have shown that melatonin prevents neuronal and astroglial apoptosis following HI injury in the perinatal period. These findings suggest that melatonin could provide clinical neuroprotection in human neonates. Although oral melatonin administration is feasible in humans, bioavailability is low due to high firstpass metabolism. Moreover, melatonin is only slightly soluble in water, light sensitive, and unstable in solution. In animal experiments, this issue has been circumvented by using organic solvents, like DMSO or ethanol, to make injectable formulations. However, such solvents may have neurotoxic effects in neonates. The overall aim of this thesis was to develop a melatonin formulation without organic solvents and to study its effect on hypoxic-ischemic brain injury. Due to the lipophilic character of melatonin, lipid-based nanoparticles, such as liposomes and nanoemulsions, represent a promising solubilizing platform for melatonin. Melatonin loaded in liposomes and nanoemulsions were developed and characterized in vitro and in vivo showing that liposomal melatonin is superior to nanoemulsions and to conventional melatonin formulation using organic solvents. In the pharmacokinetic study, melatonin loaded in liposomes, MCT-nanoemulsions, and DMSO-formulation were administrated to adult rats; nanoparticles produced a higher melatonin concentration in the brain than DMSOmelatonin, while all three formulations showed a similar concentration of melatonin in blood. Then, the optimal nanoformulation, liposomes loaded with melatonin, was used in the treatment study. There, we examined the effect of a high-dose parenteral liposomal melatonin compared to the conventional melatonin formulation in DMSO on an established HI brain injury model in neonatal rats. The results of this study indicated that liposomal melatonin is moderately neuroprotective after HI. However, we observed reduced weight gain in melatonin-treated animals, which could be caused by reduced feeding as a result of the sedative effect of melatonin. More importantly, reduced weight gain may mask the neuroprotective effect of the drug and is associated with more severe brain injury representing a complex relationship between weight gain and the outcome of the study. After statistically correcting the data for weight gain, liposomal melatonin was superior to melatonin dissolved in DMSO and to the control group (PBS). However, large variabilities were observed in all treatment groups of the in vivo model, making small differences in outcomes hard to detect. This identified a need for a more controlled and reproducible model of HI brain injury to study the effect of melatonin where factors including weight change would not have an influence on the results. Therefore, in a third study, we developed an ex vivo model of oxygen-glucose deprivation (OGD) in an NMR-compatible perfused system called a bioreactor. We optimized this model using adult rat brain slices and studied real time metabolic changes in the tissue. In this study, NMR data clearly distinguished three severity groups (mild, moderate, and severe) after 30, 60, and 120 min of OGD, respectively, compared with Control. 31P NMR spectra obtained from Controls showed that PCr/Pi levels were stable over 5 h of bioreactor experiment. Control 1H NMR spectra showed that Lac/NAA levels were stable with a tendency to gradually increase due to the recirculation of the aCSF in the perfusion system. This set-up produced satisfactory 1H and 31P spectral quality that enables observation of changes in metabolite levels before, during and after applied OGD. Together with high reproducibility and environmental control, it is an excellent model system to study the treatment effect of melatonin and other promising agents after HI event. This research has shown that it is feasible to develop a non-toxic parenteral formulation with melatonin using liposomes. The results of the treatment study on neonatal rats indicate the need for further melatonin dosage optimization. In addition, we have established a highly reproducible and controlled ex vivo model for real time measurements of energy metabolism during and after HI in brain tissue. Future studies to characterize the impact of therapeutic agents such as melatonin and melatonin-augmented hypothermia on metabolic response and mitochondrial function can now be investigated using this bioreactor system with the OGD model.