Functional studies and characterization of the light-harvesting systems of a marine alga

Abstract

CRISPR-Cas9 har vist seg som et verdifullt verktøy i gen-redigering av mikroalger. En problemstilling knyttet til Cas9-basert gen-redigering er at Cas9:guide-RNA-komplekset er promiskuøst, og kan kutte også på gen-lokasjoner som ikke fullstendig komplementerer guide-RNAet. Det har blitt gjort flere forsøk på å løse dette problemet, deriblant har man laget modifiserte Cas9 enzymer ved å erstatte aminosyrer som interagerer uspesifikt med DNA. I denne oppgaven har vi testet ut et høy-fidelitets Cas9 enzym med de samme erstatningene (hifiCas9), for å undersøke hvor effektivt den kutter på både tilsiktede (on-target) og utilsiktede (off-target) DNA-lokasjoner. Det ble funnet at enzymet oppnådde tilsiktet effektivitet tilsvarende ~75% av villtype Cas9, og at utilsiktede mutasjoner var redusert betraktelig med kun én observasjon. Således er det tydelig at høyere fidelitet kommer på bekostning av lavere aktivitet. Likevel kan hifiCas9 være et godt alternativ til diaCas9, og spesielt i tilfeller som krever at det skilles mellom svært like DNA sekvenser. De redigerte LHCF-genene koder for proteiner som inngår i lyshøstingsantennene (FCP komplekser) i Phaeodactylum tricornutum. Mutanter med trunkerte lyshøstingsantenner (TLA) har svekket evne til å absorbere lys, og kan derfor utnyttes i industrielle produksjonsprosesser der kulturene når høy tetthet og følgelig lys-begrensede forhold. TLA mutanter har vist seg å øke produktiviteten av kulturer bestående av andre algegrupper, men dette har ikke enda blitt vist for kulturer av diatoméer. Det ble derfor valgt ut tre lovende mutanter som viste en grønnaktig farge i kombinasjon med multiple tap av LHCF-gener. De ble karakterisert ved kvantifisering av vekstrater, pigment, FCP innhold, spektrale egenskaper og fotosyntetisk ytelse. Det ble vist at den minst påvirkede mutanten var nærmest lik villtypen, mens en mutant med tap av fem LHCF-gener var for svekket, og med ineffektiv fotosyntese som følge. Den mest lovende mutanten (LHCFm 6.1.11) hadde tap av lhcf1, 2 og 5 og et funksjonelt gen-fusjons-produkt av LHCF3 og LHCF4. Denne mutanten hadde redusert mengde Fuco:Chl a, mindre FucoRED absorbans, økt maksimal elektrontransportrate, og en redusert evne til å endre størrelsen på lyshøstingsantennen. Et siste mål var å teste ut potensielle TLA mutanter i lys-begrensede fotobioreaktor-kulturer, men dette pilotforsøket kom til kort på grunn av nærings-begrensning tidlig i forsøksperioden. Derfor argumenteres det for viktigheten av et rikt medium, økt lys-lengde og overvåkning av nærings-forhold ved bruk av fluorometri.

The CRISPR-Cas9 technology has presented a powerful tool for genome editing of microalgae. However, the Cas9 enzyme from Streptococcus pyogenes (SpCas9) is promiscuous and may insert unwanted modifications at off-target sites. To surpass this problem, several research groups have attempted at increasing its fidelity, one of which came up with the general strategy of replacing non-specific residues in the backbone (SpCas9-HF1) to lower the innate activity of Cas9:gRNA. The same modifications were made to create a high fidelity SpCas9 (hifiCas9) for use in diatoms. We then targeted multiple highly similar LHCF genes in the Phaeodactylum tricornutum genome to test the on- and off-target activities of hifiCas9. The findings were comparable to what has previously been reported in a human cell line, with a significantly reduced number of off-target mutagenesis events. However, a ~75% of the WT Cas9 on-target editing efficiency signified that activity was compromised for the sake of higher fidelity. Nevertheless, hifiCas9 may provide a good alternative to diaCas9, especially in applications that require high specificity. A second reason for targeting the LHCF genes was that they code for important subunits of the light-harvesting apparatus situated in the thylakoids. So-called truncated light-harvesting antenna (TLA) mutants have decreased ability to absorb light, but have been shown to increase the overall productivity of other algal species when grown in light-limited cultures. Three lhcf mutants were selected for characterization based on their gradient-like phenotypes from brown to bright green, and preliminary sequencing data that portrayed one, three or five biallelic lhcf knockout mutations. It was found that the least perturbed lhcf1 mutant was undistinctive from WT, and that a mutant with quintuple deletions (lhcf1, 2, 3, 4 and 5) was “over-the-top” causing a structurally deficient photosystem, and subsequently inefficient photosynthesis. The mutant showing the best photosynthetic performance was found to be LHCFm 6.1.11 – containing knockouts to lhcf1, 2 and 5, and an in-frame gene-fusion product of LHCF3 and LHCF4. LHCFm 6.1.11 was characterized by lowered Fuco:Chl a, decreased FucoRED absorbance, and variable fluorescence indicated an increased light-saturation index (Ek), improved maximum relative transport rate (rETRmax), and lowered ability to modify the size of its light-harvesting antennas. A final objective was set to test the performance of putative TLA mutants in light-limited cultures, but this experiment came short due to nutrient limitation. Instead we argue the importance of a rich medium, an increased light-path and monitoring of nutrient conditions – the latter which may be easily achieved by use of fluorometry.