Validering av analysemetode for amfetaminer, ecstasy-stoffer og ritalinsyre i humant serum med bruk av pipetteringsrobot og UHPLC-MS/MS

Abstract

Sentralstimulerende midler brukes både som illegale rusmidler og til medisinsk bruk. Konsentrasjonsbestemmelse i serum utføres for å avdekke misbruk eller som kontroll i for- bindelse med terapeutisk legemiddelmonitorering.

I denne oppgaven ble det utviklet og validert en ny kvantitativ analysemetode ved bruk av Ultra High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS) for de fem sentralstimulerende midlene amfetamin, metamfetamin, 4-metylendioksy- metamfetamin (MDMA), 3,4-metylendioksyamfetamin (MDA) og ritalinsyre i serum. Prøve- opparbeidelsen ble delvis automatisert med Hamilton Star pipetteringsrobot med proteinfelling og 96-brønns Ostro fosfolipidfjerningsplater. Prøvevolumet var 100 µl, og acetonitril med 1 % maursyre ble benyttet som fellingsreagens. Kolonnen som ble brukt var Acquity BEH C18-kolonne (2,1 x 50 mm, 1,7 µm, Waters) med mobilfasegradient bestående av 5 mM ammoniumformat (pH 10,1) og acetonitril. Injeksjonsvolumet var 2 µl og analyse- tiden var 3,2 minutter. Positiv elektrosprayionisering (ESI+) ble brukt i MS/MS, med to Multiple Reaction Monitoring (MRM)-overganger for hver analytt; et kvantifiseringsion og et kvalifiseringsion. 13C-merkede intern-standarder ble benyttet for alle analyttene bortsett fra for ritalinsyre, hvor den deutererte intern-standarden ritalinsyre-d4 ble benyttet.

Minste kvantifiserbare konsentrasjon for samtlige analytter lå mellom 25-200 nM, med deteksjonsgrenser lik 2,5-20 nM. Vektede kvadratiske kurver (1/x) innen analyttenes måleområde hadde R^2-verdier ≤ 0,999 for alle analyttene. Relativt standardavvik (RSD) innen en serie lå mellom 0,6-2,4 %. Mellom serier lå RSD fra 1,2 til 3,1 %, med avvik fra teoretisk verdi < 10 %. Ekstraksjonsutbytte var 77-88 %, og matrikseffekter korrigert med intern-standard var mellom 90 og 108 %. For areal av metamfetamin var overdraget etter en standard dobbelt så konsentrert som høyeste standard lik 20 % av laveste standard. Overdrag for de øvrige analyttene var < 11 %. Validering forøvrig viste tilfredsstillende resultat for variasjon i intern-standarder, ioneratio, retensjonstid, holdbarhet i opparbeidede kvalitetskontroller ved 4-10 °C og spesifisitet.

Analysemetoden skal implementeres i rutinedrift ved Avdeling for klinisk farmakologi (AKF) ved St. Olavs hospital. Metoden skal erstatte to eksisterende metoder og vil spare tid, arbeidskraft, løsemidler og prøvevolum.