Endring i proteinekspresjon av HSP70 hos CHSE-214 cellelinje, forårsaket av stress ved høy temperatur og videre optimalisering av prosedyre for visualisering på SDS-PAGE.

Abstract

For å studere endring i proteinekspresjonen av Heat Shock Protein 70 (HSP70), ble den epitellignende cellelinjen CHSE-214 benyttet. Cellekulturen ble dyrket i Leibovitz's L-15 medium, tilsatt 10% fetal bovine serum (FBS) og gentamicin, ved 20 °C.

I starten av forsøket ble det valgt å stresse cellekulturen ved en temperatur på 26 °C, hvor 9 tidsintervaller ble studert over en periode på 24 timer. Følgende tidsintervaller ble benyttet: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 og 24 timer. Cellekulturene som ble utsatt for stress ble sammenlignet med celler inkubert ved 20 °C. Endringer i proteinekspresjon ble visualisert på SDS-PAGE.

For å sikre at forsøket ga ønskede resultater ble det gjennomført en optimalisering av prosedyren, hvor ulike metoder og reagenser ble testet. En ekstraksjonsmetode med trikloreddiksyre (TCA) ble byttet ut med radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer da denne ga høyere proteinkonsentrasjoner og tydeligere bånd på SDS-PAGE. Det ble testet to ulike SDS-PAGE gel konsentrasjoner, 12% og 16%, for å finne den mest optimale for proteinuttrykk av området rundt 70 kDa. Valget falt på 12% SDS-PAGE da denne ga et klarere skille mellom proteinene i hvert enkelt proteinbånd enn 16% SDS-PAGE.

Resultatene viste et økt proteinuttrykk ved 70 kDa, som anses å være HSP70 (1). Etter 4-6 timer stress var det markant mer protein med størrelse rundt 70 kDa. Etter 12-24 timer var proteinmengden rundt 70 kDa redusert ned til kontrollnivå. Basert på resultatene kan en anta en økning av ekspresjon av HSP70 etter varmesjokk ved 26 °C, samt en redusering av proteinuttrykk rundt 70 kDa ved langvarig stress, sammenlignet med cellekontrollen inkubert ved 20 °C.

In order to study changes in the protein expression of Heat Shock Protein 70 (HSP70), the epithelial-like cell line CHSE-214 was used. The cell culture was grown in Leibovitz's L-15 medium, supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and gentamicin, at 20 °C.

At the start of the experiment, it was chosen to stress the cell culture at a temperature of 26 °C, where 9 time intervals were studied over a period of 24 hours. The following time intervals were used: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 and 24 hours. The cell cultures exposed to stress were compared to the cell controls incubated at 20 °C. Changes in protein expression were visualized on SDS-PAGE.

To ensure that the experiment yielded desired results, an optimization of the procedure was carried out, where various methods and reagents were tested. An extraction method using trichloroacetic acid (TCA) was replaced by radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer as this gave higher protein concentration and clearer band on SDS-PAGE. 16% SDS-PAGE gave narrow bands that were difficult to interpret. It was therefore used a 12% SDS-PAGE which gave a clearer distinction between the proteins on the bands.

The results showed an increased protein expression at 70 kDa, which was considered to be HSP70 (1). After 4-6 hours of stress, there was significantly more protein with the size around 70 kDa. After 12-24 hours the amount of protein around 70 kDa reduced down to the level of control. Based on the results, one can assume an increase in expression of HSP70 after heat shock at 26 °C, as well as a reduction in protein expression around 70 kDa during prolonged stress, compared to cell control incubated at 20 °C.