Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopy of calcium phosphate minerals and bone samples

Abstract

Bein er et viktig og multifunksjonelt organ, men på grunn av en aldrende befolkning har det vært en økning i sykdommer som osteoporose eller lignende tilstander. Det er derfor behov for videre studier av nanoskalaprosessene i beinmineralisering, slik at vi kan bruke vår forståelse av disse til å videreutvikle vevsteknikk rettet mot å helbrede beinsykdommer. Dessverre har dagens metoder for å studere beinprøver noen store ulemper. De er enten tidkrevende og/eller krever kjemisk merking som permanent endrer prøven. Nye teknikker som kan brukest til å studere beinprøver er derfor ønskelige. En teknikk som viser seg lovende er Koherent Anti-Stokes Raman Spredning (CARS) spektroskopi, en to lasermikroskopiteknikk basert på Raman aktive vibrasjonsmoduser i molekyler, som muliggjør sanntidsavbildning med høy romlig oppløsning. I denne teknikken genereres signalet fra fotoner som gjennomgår anti-Stokes Raman-spredning når de interagerer med et molekyl. Målet med denne masteroppgaven var derfor å se om CARS-spektroskopi kunne brukes til avbildning av beinprøver.

Avbildning ble gjort på flere ulike prøver. Dette ble gjort ved å samle anti-Stokes fotoner med spesifikke bølgelengder som tilsvarte en bestemt vibrasjon, primært fra hydroksyapatitt i prøvene, selv om avbildning også ble oppnådd ved bruk av fotoner generert fra CH-bindingsvibrasjonene. Fra de resulterende bildene ble det funnet at prøver mellom 5-20 μm ble avbildet uten problemer ved bruk av CARS-mikroskopi når man så på svampete/trabekulære bein, eller på strukturer som nervebunter og arterioler. Når man prøver å avbilde kortikalt bein, eller prøver med mye høyere tykkelse, ble signalstyrken, og dermed bildekvaliteten, merkbart dårligere. Det ble også vist at CARS-signaler fra ulike Raman-skift kunne brukes til å skille mellom ulike typer vev. Dette ble gjort ved å sammenligne signalene fra hydroksyapatitt og CH-vibrasjoner.

Når man så på CARS-signalet fra hydroksyapatitt, ble signalstyrken som en funksjon av forsinkelsen mellom pulsene til de to laserne, så vel som signalstyrken som en funksjon av den sonderte vibrasjonsfrekvensen, samlet inn fra flere prøver. Lignende spektre ble laget for signalstyrken fra CH-bindingsvibrasjonene. Resultater oppnådd ved bruk av CARS ble også sammenlignet med Raman-spektre samlet ved bruk av Raman spektroskopi.

Bone is an an essential and multifunctional organ, but, due to an an ageing population, there has been an increase in diseases such as osteoporosis or similar conditions. There is therefore a need for further study of the nanoscale processes in bone mineralization, so that we can use our understanding of these to further the development of tissue engineering aimed at healing bone diseases. Unfortunately, the current methods for studying bone samples have some major disadvantages, being either time consuming and/or requiring chemical labelling that permanently alters the sample. New techniques for the study of bone samples is therefore desirable. One technique that shows promise is Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) spectroscopy, a two laser microscopy technique based on Raman active vibrational modes of molecules, that allows for real-time imaging at a high spatial resolution. In this technique, the signal is generated by photons that undergoes anti-Stokes Raman scattering when interacting with a molecule. The goal of this master’s thesis was therefore to see if CARS spectroscopy could be used for imaging of bone samples.

Imaging was done on multiple different samples. This was done by collecting anti-Stokes photons with particular wavelengths that corresponded to a particular vibration primarily from hydroxyapatite in the samples, though images were also collected using photons generated from the CH-bonds vibrations. From the resulting images, it was found that samples between 5-20 μm were imaged without problem using the CARS microscopy when looking at spongy/trabecular bone or structures such as nerve bundles and arterioles. When trying to image cortical bone, or samples of much higher thickness, the signal strength, and therefore the image quality, became noticeably worse. It was also shown that CARS signals from different Raman shifts could be used to differentiate between different types of tissue. This was done by comparing the signals from hydroxyapatite and CH vibrations.

When looking at the CARS signal from hydroxyapatite, the signal strength as a function of the delay between the pulses of the two lasers, as well as the signal strength as a function of the probed vibration frequency, were collected from multiple samples. Similar spectra were made for the signal strength from the CH-bonds vibrations. Results obtained using CARS were also compared with Raman spectra collected using Raman spectroscopy.