The Effect of High Plasmid Copy Number and Oxygen Limitation on Growth and mCherry Production in Escherichia coli BL21 A3-mCherry

Abstract

Rekombinant proteinproduksjon har et bredt spekter av bruksområder som kan brukes i ulike industrier. Imidlertid står rekombinant proteinproduksjon overfor noen utfordringer, en av dem er jevn oksygenfordeling i reaktorene og et høyt plasmid kopinummer (PCN). Disse utfordringene fører til stressresponser i vertsorganismen, noe som resulterer i ineffektiv proteinproduksjon. Escherichia coli (E. coli ) er en av de mest brukte vertsorganismene for dette formålet, på grunn av sin velkjente genetikk, dens doblingstid, og kostnadseffektivitet. I denne masteroppgaven ble E. coli BL21 stammen som var transformert med en pVB ekspresjonsvektor til et genmodifisert RK2-plasmid med et XylS/Pm ekspresjonssystem brukt. Stammen var ampicillin-resistent og produserte mCherry med et plasmid kopinummer (PCN) på 40. Undersøkelser ble gjort for å observere hvilke effekter et høyt plasmid kopinummer og oksygenbegrensning ville ha på veksten og metabolismen til E. coli BL21 under rekombinant proteinproduksjon. Kultiveringer ble utført i 1000 ml benke-skala bioreaktorer og prøver for vekst, proteinproduksjon, utskilte metabolitter og intracellulære metabolitter ble samlet inn. Prøveforberedelser ble gjort for å utføre teknikker som høypresisjonsvæskekromatografi (HPLC), IC-MS/MS, LC-MS/MS, SDS-PAGE og Western Blot for å få kunnskap om den metabolske tilstanden til vertsorganismen. Gjennom denne oppgaven ble det funnet at induksjon av mCherry-produksjon førte til vekstreduksjon i E. coli. Det så ut til at cellen ikke var i stand til å gjenoppta veksten når oksygentilførselen var begrenset. Det ble også funnet at oksygenbegrensning og plasmidvedlikehold hadde effekter på ”metabolittpoolen” i A3-mCh-stammen. Til tross for stresset som ble påført stammen, så det ut til at den klarer å opprettholde homeostase, redoksbalanse og en høy proteinproduksjonshastighet, selv under suboptimale vekstforhold.

Recombinant proteins have a wide range of applications that may be utilized in various industries. However, recombinant protein production faces some challenges, one of them being even oxygen distribution in the reactors and high plasmid copy number (PCN). These challenges induce stress responses in the expression host, resulting in ineffective protein production. Escherichia coli (E. coli ) is one of the most commonly used expression host for this purpose, due to its well-known genetics, its doubling time, and its cost-effectiveness. In this master thesis, E. coli BL21 strain transformed with a pVB expression vector into a genetically modified RK2 plasmid with a XylS/Pm expression system was used. The strain was ampicillin-resistant and produced mCherry with a PCN of 40. Investigations were made to observe the effects a high plasmid copy number and oxygen limitation would have on growth characteristics and metabolism of E. coli BL21 during recombinant protein production. Cultivations were performed in 1000 mL bench-scale bioreactors and samples for growth, protein production, overflow metabolites, and endometabolites were obtained. Sample preparations were made to perform techniques such as High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), IC-MS/MS, LC-MS/MS, SDS-PAGE, and Western Blot to obtain knowledge about the metabolic state of the expression host. Throughout this thesis, it was found that induction of mCherry production led to growth arrest in E. coli. It appeared that the cell was not able to resume growth when oxygen supply was limited. It was also found that oxygen limitation and plasmid maintenance had effects on the metabolite pool in the A3-mCh strain. Despite the stress inflicted upon the strain, it appeared to maintain homeostasis, redox balance, and a high protein production rate, even during suboptimal growth conditions.