Ekstraksjon av bioaktive forbindelser fra Alaria esculenta ved bruk av pulserende elektrisk felt teknologi

Abstract

Marine makroalger er rike på bioaktive forbindelser, som er naturlige stoffer med spesialiserte biologiske funksjoner, inkludert antioksidative og antimikrobielle egenskaper. Det er en økende etterspørsel etter naturlige antioksidanter i næringsmiddelindustrien, og egenskapene til de bioaktive forbindelsene gjør dem også interessante for industrier som farmasi, kosmetikk og bioteknologi. Tradisjonelle ekstraksjonsmetoder innebærer bruk av organiske løsemidler, som er knyttet til negative påvirkninger på helse og miljø. Derfor er det av interesse å utvikle mer miljøvennlige ekstraksjonsmetoder for disse stoffene.

Flere studier har vist at pulserende elektrisk felt (PEF)-teknologi kan øke ekstraksjonsutbyttet fra ulike råstoff, blant annet en økning av polyfenoler fra brunalgen Alaria esculenta (A. esculenta) med opptil 38,7%. Denne studien undersøkte anvendelsen av PEF som forbehandling for ekstraksjon av bioaktive forbindelser fra A. esculenta, med vann som løsemiddel. Målet med oppgaven var å undersøke om PEF-behandlingen kunne gi økt utbytte av bioaktive forbindelser sammenlignet med tradisjonell solid-liquid ekstraksjon (SLE) med to løsemidler: vann og etanol:vann (30:70). Utbyttet av bioaktive forbindelser ble kvantifisert ved å analysere ekstraktenes kjemiske karakteristikk, samt deres in vitro antioksidative og antimikrobielle egenskaper. PEF-parameterne ble optimalisert med mål om å oppnå høyest mulig utbytte av bioaktive forbindelser. Optimaliseringen resulterte i et forsøksdesign hvor elektrisk feltstyrke (2, 4 og 6 kV/cm) og antall pulser (10, 100 og 200) var varierende parametere, og de ferdige ekstraktene hadde en prøvekonsentrasjon på 10 g tørket A. esculenta per liter løsemiddel. Ekstraktenes kjemiske karakteristikk ble undersøkt ved å måle totalt polyfenolinnhold (TPC) ved hjelp av Folin-Ciocalteu metoden, innhold av fukoxantin ved hjelp av væskekromatografi (HPLC), samt pH-verdien til ekstraktene. Videre ble ekstraktenes antioksidative kapasitet kvantifisert in vitro med følgende tre metoder: 2,2´-azin-bis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) og ferric reducing antioxidant power (FRAP). Den antimikrobielle effekten mot bakteriene Listeria innocua (L. innocua) og Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) ble avslutningsvis analysert for utvalgte ekstrakter ved bruk av 96-brønnsplate inhiberingsanalyse.

Resultatene viste at elektrisk feltstyrke og prøvens konduktivitet hadde stor betydning for hvorvidt forsøkene på PEF-maskinen var gjennomførbare uten feilmeldinger. Det antas at det eksisterer mer optimale parametere for PEF på A. esculenta enn dem som ble benyttet i denne oppgaven, og at både metoden og parameterinnstillingene har forbedringspotensial. TPC-analysene viste at etanol:vann-ekstraktene hadde signifikant høyere innhold av polyfenoler enn de andre ekstraktene, og at PEF ved 4 kV/cm ga høyere utbytte enn 6 kV/cm uavhengig av antall pulser. Ingen signifikante forskjeller ble funnet mellom PEF- og vannekstraktene uten PEF-behandling. Analysen av fukoxantin-innhold ga ingen detekterbare resultater, noe som indikerte at den lave prøvekonsentrasjonen var begrensende for metoden. Resultatene fra pH-målingene viste at etanol:vann hadde signifikant lavere pH enn de andre gruppene, noe som kan relateres til denne prøvens høyere polyfenolinnhold, og muligens høyere innhold av organiske syrer.

Resultatene fra ABTS viste ingen signifikante forskjeller i Radical Scavenging Activity (RSA%) mellom hverken PEF- eller SLE-gruppene, men det ble observert en ikke-signifikant tendens som antydet at PEF-ekstraktene lå mellom vannekstraktet og etanol:vann. DPPH viste heller ingen signifikante forskjeller i RSA% mellom noen av gruppene. FRAP viste at PEF ved 4 kV/cm og 10 pulser hadde ekstrahert en større andel forbindelser med evne til å redusere Fe2+, enn PEF ved 6 kV/cm og 100 pulser. Korrelasjonsanalysen viste signifikant korrelasjon mellom FRAP og TPC for PEF-ekstraktene. De antimikrobielle analysene ble kun utført på vannekstraktene uten PEF-behandling, og PEF-ekstraktene som ble behandlet med 4 kV/cm. Analysene viste at vannekstraktet hadde en svak, men signifikant bedre inhibering av L. innocua enn PEF-ekstraktet ved 4 kV/cm og 10 pulser, mens det motsatte var tilfellet for inhibering av P. fluorescens. De mikrobiologiske resultatene var imidlertid usikre, og konsentrasjonen av inhiberende stoffer var sannsynligvis for lav til å gi utslag på inhiberingsanalysen.

Basert på resultatene presentert i denne studien ble det vurdert at PEF ikke ga signifikant høyere utbytte av bioaktive forbindelser enn SLE med vann som løsemiddel. Til tross for dette ble det påpekt at de signifikante forskjellene i TPC-analysen, mellom SLE og PEF-gruppene, ble utjevnet av de antioksidative analysene. I tillegg var korrelasjonskoeffisienten mellom FRAP og TPC lavere for PEF enn SLE. Dette indikerte at PEF-behandlingen hadde ekstrahert andre forbindelser enn polyfenoler, med antioksidative egenskaper, i større grad enn SLE. På grunn av dette ble det konkludert med at PEF kan være en egnet forbehandling for ekstraksjon av bioaktive forbindelser fra A. esculenta, med forutsetning om videre optimalisering av prosessparametere og metode for PEF, samt kvantifisering av forbindelser utover polyfenoler.

Marine macroalgae are rich in bioactive compounds, which are natural compounds with specialized biological functions, including antioxidative and antimicrobial properties. There is an increasing demand for natural antioxidants in the food industry, and the properties of these bioactive compounds also make them interesting for industries such as pharmaceuticals, cosmetics, and biotechnology. Traditional extraction methods involve the use of organic solvents, which are associated with negative impacts on health and the environment. Therefore, it is of interest to develop more environmentally friendly extraction methods for these compounds. Several studies have shown that pulsed electric field (PEF) technology can increase extraction yields from various raw materials, including an increase of polyphenols from the brown algae Alaria esculenta (A. esculenta) by up to 38.7%. This study investigated the application of PEF as a pretreatment for the extraction of bioactive compounds from A. esculenta, using water as the solvent. The aim of this study was to determine if PEF treatment could yield higher amounts of bioactive compounds compared to traditional solid-liquid extraction (SLE) with two solvents: water and ethanol:water (30:70). The yield of bioactive compounds was quantified by analyzing the chemical characteristics of the extracts, as well as their in vitro antioxidant and antimicrobial properties.

PEF parameters were optimized with the goal of achieving the highest possible yield of bioactive compounds. The optimization resulted in an experimental design where the electric field strength (2, 4, and 6 kV/cm) and the number of pulses (10, 100, and 200) were variable parameters, and the final extracts had a sample concentration of 10 g dried A. esculenta per liter of solvent. The chemical characteristics of the extracts were examined by measuring; the total polyphenol content (TPC) using the Folin-Ciocalteu method, the content of fucoxanthin using high performance liquid chromatography (HPLC), and the pH value of the extracts. Furthermore, the antioxidant capacity of the extracts was quantified in vitro using the following three methods: 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), and ferric reducing antioxidant power (FRAP). The antimicrobial effect against the bacteria Listeria innocua (L. innocua) and Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) was finally analyzed for selected extracts using a 96-well plate inhibition assay.

The results showed that electric field strength and the conductivity of the sample were crucial for whether the experiments on the PEF-machine could be done successfully without errors. It was assumed that there exist more optimal parameters for PEF on A. esculenta than those used in this study, and that both the method and parameter settings have potential for improvement. TPC analyses showed that the ethanol:water extracts had significantly higher polyphenol content than the other extracts, and that PEF at 4 kV/cm yielded higher outputs than at 6 kV/cm, regardless of the number of pulses. No significant differences were found between PEF and water extracts without PEF treatment. The fucoxanthin content analysis gave no detectable results, indicating that the low sample concentration was limiting for the method. The pH measurements showed that ethanol:water had significantly lower pH than the other groups, which may be related to the higher polyphenol content, and its possibly higher content of organic acids.

The ABTS results showed no significant differences in Radical Scavenging Activity (RSA%) between the PEF and SLE groups, but a non-significant tendency was observed indicating that the PEF extracts were between the water extract and ethanol:water. DPPH also showed no significant differences between any of the groups. FRAP showed that PEF with 4 kV/cm and 10 pulses had extracted a larger share of compounds with the ability to reduce Fe2+ than PEF at 6 kV/cm and 100 pulses. Correlation analysis showed a significant correlation between FRAP and TPC for the PEF extracts. The antimicrobial analyses were only performed on the water extracts without PEF treatment and the PEF extracts treated with 4 kV/cm. The analyses showed that the water extract had a weak but significantly better inhibition of L. innocua than the PEF extract at 4 kV/cm and 10 pulses, while the opposite was true for the inhibition of P. fluorescens. However, the microbiological results were uncertain, and the concentration of inhibitory compounds was likely too low to show an effect in the inhibition assay.

Based on the results presented in this study, it was assessed that PEF did not yield significantly higher bioactive compound extraction than SLE with water as the solvent. Despite this, it should be noted that the significant differences in the TPC analysis between the SLE and PEF groups were evened out in the antioxidant analyses. Additionally, the correlation coefficient between FRAP and TPC was lower for PEF than for SLE. This indicated that the PEF treatment had extracted other compounds with antioxidant properties, besides polyphenols, to a greater extent than SLE. Because of this, it was concluded that PEF may be a suitable pretreatment for the extraction of bioactive compounds from A. esculenta provided that further optimization of process parameters and the method for PEF, as well as the quantification of compounds beyond polyphenols, is conducted.